Nature丨从脂解副产物到信号分子：甘油重塑TNAP功能

撰文|Sure

TNAP（tissue-nonspecific alkaline phosphatase，组织非特异性碱性磷酸酶）是一种可水解多种磷酸化底物的酶【1】。它最经典的功能是在骨骼中调控矿化，在成骨细胞中，TNAP通过GPI anchor（glycosylphosphatidylinositol anchor，糖基磷脂酰肌醇锚）固定在质膜上，其胞外活性位点可水解PPi（pyrophosphate，焦磷酸盐），而PPi是骨矿化的强抑制因子。TNAP将PPi转化为Pi（inorganic phosphate，无机磷酸盐），从而促进钙磷沉积和骨形成【2】。因此，编码TNAP的Alpl基因突变会导致低磷酸酶症（hypophosphatasia），表现为从围产期骨矿化失败到成人骨质疏松样症状的一系列疾病。近年来，TNAP还被发现不仅存在于骨组织，也在棕色脂肪细胞中参与产热。棕色脂肪组织（brown adipose tissue,BAT）通过消耗能量产生热量，其中既有依赖 UCP1的经典产热，也有不依赖UCP1的产热机制。TNAP定位于棕色脂肪细胞线粒体内膜，可水解由 CKB生成的PCr（phosphocreatine，磷酸肌酸），共同驱动FCC（futile creatine cycle，无效肌酸循环）【3-7】。这个循环通过反复进行肌酸磷酸化和去磷酸化，加速ATP周转、氧气消耗和产热。但是，一个关键问题一直不清楚，TNAP的活性在生理状态下到底由什么分子调控？

近日，来自加拿大麦吉尔大学的Lawrence Kazak课题组在Nature上发表了论文Glycerol-driven TNAP activation in thermogenesis and mineralization。该研究揭示甘油作为信号代谢物通过变构激活TNAP，协调调控棕色脂肪产热与骨矿化，确立了其在能量代谢与矿化疾病中的关键作用。

棕色脂肪产热受到去甲肾上腺素刺激，而去甲肾上腺素会激活脂解，产生游离脂肪酸和甘油。游离脂肪酸已知可以激活UCP1依赖性产热，但UCP1非依赖性产热，特别是FCC如何被快速激活并不清楚。由于TNAP是FCC中的关键酶，作者推测冷刺激或去甲肾上腺素刺激产生的某些代谢物可能直接调控TNAP，从而增强FCC。研究发现，去甲肾上腺素刺激棕色脂肪细胞可显著上调Alpl基因表达，提示TNAP与产热激活有关。随后对热中性环境和寒冷暴露小鼠的BAT进行代谢组分析，筛出多种寒冷诱导升高的代谢物。作者纯化重组TNAP并检测其水解PCr产生Pi的能力，发现非磷酸化代谢物中，甘油是最强的TNAP激活剂。甘油可剂量依赖性增强TNAP介导的PCr水解和PPi水解，而另一种脂解产物棕榈酸没有这种作用。人源TNAP也能被甘油激活，说明这一机制具有保守性。进一步实验表明，甘油不是TNAP反应中的磷酸受体，而是作为信号代谢物增强酶活。在线粒体层面，甘油显著增强小鼠和人棕色脂肪细胞线粒体中内源性TNAP对PCr的水解。作者还建立了FCC功能检测体系，证明PCr驱动的NADH氧化必须依赖CKB和TNAP，而甘油可增强这一过程。遗传敲低或药物抑制TNAP会特异性削弱PCr驱动的FCC活性，说明甘油通过激活TNAP加速FCC，而不是通过其他线粒体途径泛化增强呼吸。这部分结果证明甘油是TNAP的直接代谢激活因子，可增强TNAP介导的PCr水解，从而促进CKB–TNAP共同驱动的无效肌酸循环产热。

接下来，作者继续研究甘油如何在结构上激活TNAP？作者解析了小鼠TNAP与PCr和甘油结合的晶体结构，发现每个TNAP二聚体上有多个甘油结合位点。其中最关键的是一个靠近GPI锚定区域的远端表面口袋，由 Lys52、Thr321、Ser367、Asp370 等残基构成。甘油在此处与Asp370、Lys52和Ser367形成氢键。突变Asp370或Lys52后，TNAP的基础水解活性仍可保留，但甘油诱导的PCr水解增强消失，说明该口袋专门负责甘油依赖性变构激活。进一步的氢氘交换质谱（hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry,HDX-MS）显示，甘油结合后TNAP多个区域构象动态发生改变，尤其是靠近甘油口袋及远端调控区域的柔性下降，提示甘油通过降低构象波动、稳定活化构象来增强酶活。PCr与甘油共同存在时，这种稳定作用更强，说明底物结合和甘油变构激活具有协同效应。在功能层面，作者将野生型TNAP、催化失活突变体以及甘油口袋突变体重新表达于Alpl缺失棕色脂肪细胞中。结果显示，只有野生型TNAP能恢复甘油诱导的PCr水解和FCC相关呼吸；甘油口袋突变体虽有基础活性，却不能恢复TNAP介导的产热。进一步在脂肪细胞缺失Alpl和Ucp1的双敲小鼠中进行体内恢复实验，发现只有野生型TNAP能恢复去甲肾上腺素诱导和寒冷诱导的能量消耗，甘油口袋突变体不能恢复。这些结果表明，TNAP存在一个靠近GPI锚定区域的变构甘油口袋，甘油通过该口袋稳定TNAP的活化构象并增强PCr水解；该口袋在细胞线粒体FCC和小鼠体内产热中都是必需的。

文章的最后，作者提出了一个疑问：TNAP甘油口袋是否只在棕色脂肪产热中重要，还是也参与TNAP经典功能——骨矿化？为了解释这个问题，作者首先利用UK Biobank全外显子测序数据进行基因负担分析，发现位于TNAP甘油口袋的有害Alpl错义变异与较低血浆碱性磷酸酶活性和较低骨密度显著相关。这种关联强度仅次于活性位点突变，说明甘油口袋是TNAP功能中的关键结构域。部分甘油口袋突变也已被Alpl突变数据库标注为低磷酸酶症致病突变，进一步支持其临床相关性。随后作者在体外成骨细胞矿化模型中验证该机制。TNAP通过水解PPi解除其对矿化的抑制，从而促进钙磷沉积。野生型TNAP可以有效解除PPi抑制并恢复矿化，而甘油口袋突变体明显延迟或削弱矿化能力；催化失活突变体则完全不能恢复。作者进一步纯化人源TNAP及多个与低骨密度相关的甘油口袋变异体，发现甘油可以增强野生型人源TNAP对PPi的水解，但多数甘油口袋突变体无法响应甘油。结构建模显示，这些突变会破坏维持甘油口袋构象的氢键网络或改变口袋大小，从而降低甘油结合能力。即使在基础酶活校正相同的条件下，甘油口袋突变体仍然无法像野生型TNAP那样充分恢复成骨细胞矿化。这表明TNAP甘油口袋不仅调控棕色脂肪产热，也参与骨矿化；人类Alpl甘油口袋突变会降低TNAP活性、削弱PPi水解和成骨细胞矿化，并与低骨密度和低磷酸酶症相关表型相关。

总的来说，该研究发现甘油不仅是脂解副产物，而是可以直接结合并变构激活 TNAP 的信号代谢物，从而增强棕色脂肪线粒体中的无效肌酸循环产热。同时，TNAP的甘油结合口袋也对成骨细胞矿化至关重要，人类该区域突变与低碱性磷酸酶活性和低骨密度相关。该研究揭示了甘油调控TNAP活性的跨组织机制，将能量代谢产热与骨矿化联系起来，并提出TNAP甘油口袋可能是治疗肥胖和骨矿化疾病的新靶点。

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41586-026-10396-9

制版人： 十一

参考文献

1. Millan, J. L. Alkaline phosphatases: structure, substrate specificity and functional relatedness to other members of a large superfamily of enzymes.Purinergic Signal.2, 335–341 (2006).

2. Reznikov, N. et al. Biological stenciling of mineralization in the skeleton: local enzymatic removal of inhibitors in the extracellular matrix.Bone138, 115447 (2020).

3. Rahbani, J. F. et al. ADRA1A–Gαq signalling potentiates adipocyte thermogenesis through CKB and TNAP.Nat.Metab. 4, 1459–1473 (2022).

4. Sun, Y. et al. Mitochondrial TNAP controls thermogenesis by hydrolysis of phosphocreatine.Nature593, 580–585 (2021).

5. Bunk, J. et al. The futile creatine cycle powers UCP1-independent thermogenesis in classical BAT.Nat. Commun.16, 3221 (2025).

6. Bunk, J. et al. Creatine kinase B mediates UCP1-independent beige fat thermogenesis via the futile creatine cycle in mice.Mol.Metab.98, 102193 (2025).

7. Rahbani, J. F. et al. Creatine kinase B controls futile creatine cycling in thermogenic fat.Nature590, 480–485 (2021).

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