Adv Sci｜柳红/李佳团队开发用于鉴定USP1变构抑制剂的高效荧光偏振探针

泛素特异性 蛋白酶 1 （ Ubiquitin-specific protease 1, USP1 ）在多种肿瘤中表达失调， 已成为极具 潜力的抗肿瘤靶点【1-3】。 研究表明， U SP1 可通过变构机制实现高选择性抑制【4】。 然而， 传统的“ 泛素 - 罗丹明 -110 ”筛选方法常 会 得到许多具有不同作用机制（ Mechanisms of action, MOA ）的小分子配体 （ 包括 泛筛选干扰化合物和非特异性化合物 ）， 难以 区分变构 抑制剂 与 其他 抑制剂 ， 这极大限制了靶向 USP1 变构抑制剂的开发进程 。

近日 ，中国科学院上海药物 研究 所 柳红 / 李佳 / 李淳朴 / 周宇波 团队 在 A dvanced S cience 杂志上 发表了题为 Discovery of a Potent Fluorescence Polarization Probe for Identifying USP1 Allosteric Inhibitors 的文章。 该 研究开发了靶向 USP1 变构位点的荧光探针及相应的荧光偏振 （ Fluorescence polarization, FP ） 分析方法 ， 并报道了一类对弥漫性大 B 细胞淋巴瘤（ DLBCL ） 细胞系 具有强效抗增殖活性的 特异性 USP1 抑制剂 。

首先， 为了合理设计探针该团队分别分析了 已报道的 U SP1 变构抑制剂 M L323 和 KSQ-4279 的结合模式 ， 保留 了 关键氢键作用 并 引入四 氢异喹啉 骨架。 其次， 荧光基团选用异硫氰酸荧光素 并用柔性连接链 在溶剂暴露区 将 配体 与荧光基团连接 。 最终， 设计并合成了连接链长度不同的荧光探针 6-1 和 6-2 。通过生物膜干涉技术和光谱性质测试表明，探针 6 -2 表现出更高的结合亲和力且荧光性能优良。

进一步，该团队 采用泛素罗丹明 -110 荧光法测定了已知变构抑制剂 KSQ-4279 的酶抑制活性，以及新方法利用探针 6-2 建立的 FP 竞争结合实验测定了 KSQ-4279 以及非变构抑制剂的位点占据率。在基于探针 6-2 的 FP 实验中， KSQ-427 表现出 与经典测试方法相当 的 活性结果 。与此形成鲜明对比的是，非变构抑制剂均无法有效竞争探针 6-2 与 USP1 的结合。 上述结果充分证实了基于新型荧光偏振探针建立的筛选体系在识别 U SP1 变构抑制剂方面的准确性。

另一方面， 本工作发现的新型衍生物 14a 对 USP1 的酶抑制活性（ IC 50 = 29.9 ± 1.5 nM ）优于临床 化合物 KSQ-4279 （ IC 50 = 47.1 ± 3.0 nM ） 。 细胞水平上， 14a 对 DLBCL 细胞系 OCI-LY10 及 TMD-8 表现出强效抗增殖活性， IC 50 值分别为 240.93 ± 43.35 nM 和 29.9 ± 8.8 nM 。机制研究表明， 14a 可剂量依赖性诱导 OCI-LY10 细胞凋亡、引起 S 期阻滞、下调促癌蛋白 MYC 的表达并促使 Ub -PCNA 累 积。在 USP1 高表达 的 MDA-MB-436 及 CAOV-3 细胞中， 14a 与奥拉帕利联用呈现协同抗增殖效应，其效果与 KSQ-4279 相当。分子模拟揭示了 14a 与 USP1 的相互作用模式。体内研究表明， 14a 具有 可接受 的药代动力学 性质 ，且在 OCI-LY10 异种移植瘤模型中可有效抑制肿瘤生长，未观察到明显毒性。

该研究不仅为靶向 USP1 变构抑制剂的发现提供了一种高效的新型荧光探针和 FP 分析平台，还发掘了具有 开发前景的新型先导化合物 14a ，为后续的 结构优化与抗肿瘤机制研究奠定了坚实基础。

原文链接：http://doi.org/10.1002/advs.75350

制版人：十一

参考文献

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[2] S. Antonenko, M. Zavelevich, G. Telegeev,Acta biochimica Polonica2023, 70 , 219-231.

[3] X.-Y. Li, J.-C. Wu, P. Liu, Z.-J. Li, Y. Wang, B.-Y. Chen, C.-L. Hu, M.-Y. Fei, P.-C. Yu, Y.-L. Jiang, C.-H. Xu, B.-H. Chang, X.-C. Chen, L.-J. Zong, J.-Y. Zhang, Y. Fang, X.-J. Sun, K. Xue, L. Wang, S.-B. Chen, S.-Y. Jiang, A.-l. Gui, L. Yang, J. J. Gu, B.-H. Yu, Q.-l. Zhang, L. Wang,Leukemia2023, 37 , 164-177.

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