【珍藏版】Nat RevGenetics丨亓磊/W.E.Moerner/朱彦宇:从“基因剪刀”到“分子显微镜”，CRISPR开启活细胞4D基因组动力学观测新纪元

导读

三维基因组的结构与动态变化，对于维持基因组稳定性、调控基因复制与转录、执行细胞功能乃至疾病的发生都至关重要。传统的基因组研究多依赖于“静态快照”，而近年来兴起的CRISPR活细胞成像技术，正让科学家们能够在活细胞中“实时直播”基因组的三维动态，开启了观测生命“第四维度” ——时间的全新篇章。

近日，斯坦福大学亓磊教授与2014年诺贝尔化学奖得主W.E. Moerner教授的深度跨学科合作，朱彦宇博士领衔完成，在Nature Reviews Genetics发表一篇题为CRISPR-Cas-based live cell imaging of genome dynamics的综述。该综述系统阐述了CRISPR技术如何从“基因剪刀”革命性地化身为“分子显微镜”，全面梳理了基于CRISPR的活细胞DNA和RNA成像领域的技术发展历程，并深入探讨了这些前沿技术如何推动我们对染色质运动、转录调控和疾病机制的理解。文章全面梳理了从工具开发、实验设计到数据分析的全流程，堪称三维基因组领域研究者的“百科全书式”的指南。

从“静态照片”到“实时电影”：观测基因组的第四维度

人类基因组，将展开后线性长度达2 米的DNA分子压缩折叠至微米级的细胞核内。这种精妙的三维折叠，形成了区室、拓扑关联域（TADs）和染色质环等复杂结构，它们的动态变化和相互作用，精密地调控着基因表达、细胞特性乃至疾病的发生。癌症、神经系统疾病、发育异常等许多疾病的发病机制，往往与三维基因组结构异常有关。然而，现有认知多来自间接的固定细胞检测技术，比如传统的FISH和Hi-C技术，其虽然能提供高分辨率的“静态快照”，却无法捕捉其动态过程，如同绘制了一幅精美的静态“建筑图”，却无法告诉我们细胞这座“城市”的实时交通——染色质的动态行为。而基因转录、DNA损伤修复、细胞分化等核心生命过程，本质上都是动态的。要破解这些“生命暗码”，我们必须引入第四个维度——时间。

早期的活细胞成像技术（如LacO/TetO系统）需要在基因组中插入巨大的人工序列，这个过程不仅耗时复杂，而且可能干扰内源染色质的天然结构与功能。CRISPR技术的出现彻底改变了这一局面。它不仅是一种强大的基因编辑技术，更可通过巧妙的改造，引入荧光标记，化身为一台可编程的“分子GPS”。其核心原理是：利用亓磊教授发明的核酸酶失活的Cas9蛋白dCas9（nuclease-dead Cas9）与序列特异性的单向导RNA（sgRNA）相结合，在不切割DNA的情况下，将荧光标记精确靶向内源基因组位点。

2013年，亓磊和黄波实验室合作将绿色荧光蛋白（EGFP）与dCas9蛋白融合， 成功实现了对端粒和MUC4基因内含子中的重复序列的活细胞成像。这项开创性工作证明了CRISPR成像的可行性。这一可编程荧光标记系统，为活细胞中特定位点染色质的实时成像提供了的平台，从而实现了从静态描述到动态观测的革命性飞跃。

CRISPR成像工具箱的发展

最初的CRISPR DNA成像面临信噪比 (Signal-to-Noise Ratio，SNR) 过低的核心挑战，尤其在观测非重复序列时。由于单个荧光蛋白信号微弱，易被大量游离荧光分子的背景噪音淹没，因此早期方法多靶向重复序列。重复序列能“天然放大”信号：其多个靶点可被同一种sgRNA识别，从而聚集荧光分子，形成可观测的“光斑”。然而，增强子、启动子等关键调控元件多为非重复序列。为攻克此难题，在过去的十二年中，领域内发展出多种创新策略。本综述即从提升信噪比、实现多色成像、扩展观测目标（从重复到非重复序列，从DNA到RNA）等维度，梳理其中的关键进展。

（一）重复基因组序列的成像

1.提升信噪比——增强信号和降低背景

提升信噪比最直接的思路就是增强目标信号。策略包括：直接在dCas9上融合多个荧光蛋白；另一种是以CRISPR-SunTag为代表的招募系统，通过在dCas9上融合多个GCN4多肽标签，来招募大量荧光抗体片段（single-chain variable fragments ，scFv），从而实现信号的数十倍放大。

提升SNR的另一个策略是降低背景。比如CRISPR-LIBR利用光诱导系统，将细胞核中未结合的荧光复合物转移到细胞质。或如ArrayG/N和fCRISPR等技术，探针仅在结合到目标位点时才被点亮。

2.多色和多模态成像

要理解不同基因位点（如增强子与启动子）的协同作用，就必须同时观测多个目标。

一种方法是利用来自不同物种的正交dCas系统（如dSpCas9, dSaCas9）融合不同颜色的荧光蛋白，但此法受限于可用系统的数量。另一类方法是改造sgRNA二级结构，利用其上融合的核酸适配体（Aptamer）招募荧光标记的结合蛋白。如Thoru Pederson实验室开发的CRISPRainbow利用多种正交适配体（如MS2, PP7, boxB）招募不同颜色的荧光蛋白。这种设计产生了一个具有三种原色（通过组合原色得到三种次级颜色）的CRISPR复合物组合文库，实现“光谱编码”，从而实现了对六个不同重复区域的成像。后续的优化技术，如CRISPR-Sirius和CRISPR-16xMS2-MCP，通过增加适配体拷贝数，进一步增强信号，甚至实现了对低重复及非重复区域的成像。这种直接将颜色信息“编织”进sgRNA的设计，极大地扩展了CRISPR成像的应用。

此外，为同步观察DNA、RNA和蛋白质，CRISPR-Tag和TriTag等技术可同时标记基因位点并追踪其转录和翻译产物，揭示基因调控全景。

3.利用合成有机染料的CRISPR成像方法

相比于荧光蛋白，有机染料分子更小、亮度更高、光稳定性更好（其在光淬灭前通常能发射约10⁶个光子，而荧光蛋白仅为约10⁵个）。但需要精巧的化学偶联策略将其精确地“安装”到CRISPR系统上。主要策略包括：

1. HaloTag系统： 利用dCas9融合的HaloTag酶与带染料的配体发生共价结合，实现标记。

2. 荧光发生适体（Fluorogenic Aptamer）： sgRNA与荧光发生RNA适体（如Broccoli适体）融合，这些适体能结合并增强基特定小分子（比如DFHBI）的荧光。

3. Molecular Beacon（CRISPR-MB）：CRISPR-MB技术利用一个发夹状的Molecular Beacon。其在游离时荧光被“淬灭”，只有与sgRNA上的靶序列结合后，才打开结构并增强荧光。

4. 荧光发生CRISPR（fCRISPR）： 系统中的荧光蛋白由于存在降解域（degron domain）而不稳定。只有荧光蛋白通过与靶向的Pepper aptamer sgRNA结合时，才能免于降解并发光，从而降低的背景。

5. LiveFISH（live-cell FISH）： 通过在体外预先组装dCas9与荧光染料标记的RNA形成荧光核糖核蛋白（fluorescent ribonucleoproteins, fRNPs），再将其递送到细胞内，实现了高度的灵活性和通用性，并已成功应用于原代细胞。但由于信噪比的限制，第一代LiveFISH仅适用于对重复基因组区域进行成像。

（二）非重复序列的成像挑战

绝大多数基因及基因组调控元件如增强子、启动子都属于非重复序列。对非重复序列成像极具挑战，因其缺乏重复序列的天然信号放大效应。单个基因座只能招募少量荧光复合物，其微弱信号易被背景噪音淹没。为此，研究人员主要采用两种优化策略：增强单个探针的信号，或增加靶向同一区域的sgRNA数量。

1 基于少量sgRNA的信号放大

该策略通过分子工程，最大化单个成像复合物的荧光信号，在简化递送的同时提高信噪比。比如CRISPR-16xMS2-MCP通过在sgRNA上整合多个MS2适配体来招募更多荧光蛋白。CRISPR-FISHer利用蛋白三聚化诱导荧光蛋白在靶点发生相分离以富集荧光蛋白。CRISPR-QD利用高量子产率和高光稳定性的量子点（quantum dots ，QD）作为荧光基团。CRISPR-dual-FRET通过CRISPR–MB与Förster resonance energy transfer (FRET) 相结合，利用FRET发生的邻近效应抑制背景。CRISPR-Casilio利用PUF RNA-结合域，为多色成像提供“编码空间”。SIMBA系统利用SunTag和HP1α的相互作用，实现信号放大并兼具基因操控功能。SNP-CLING 利用 dCas9 的PAM识别特异性，实现单核苷酸精度的等位基因特异标记。

2. 使用大量sgRNA“平铺”目标区域：

该策略通过使用大量覆盖目标区域的sgRNA，以数量累积的方式将多个微弱信号叠加成可检测的光斑。

DNA载体共递送： 早期通过慢病毒或多质粒共转染实现，效率和均一性差。后续通过层级克隆将多个sgRNA整合入单一载体（如多盒串联组装策略和CARGO）或利用Cas12a自我加工CRISPR阵列（CRISPRdelight）简化递送流程和提高效率。

体外组装与递送: 该策略绕过了细胞内转录翻译过程。CAS-LiveFISH直接递送荧光dCas9蛋白与体外转录（IVT）的sgRNA。而亓磊实验室开发的Oligo-LiveFISH则更进一步，直接使用化学合成并预先标记好荧光染料的sgRNA寡核苷酸池。该方法具有极高的通用性，成功应用于原代细胞等难转染细胞，并与超高分辨率显微镜结合，实现了纳米级时空分辨率的基因组追踪。

（三）RNA成像

为关联染色质动态与基因表达，需同步成像RNA。CRISPR系统利用改造的RCas9（需PAMmer引导）或天然RNA靶向蛋白dCas13，实现了内源RNA的活细胞追踪。dCas9（靶向DNA）和dCas13（靶向RNA）的正交组合，更可在同一细胞内对DNA与RNA进行同步多色成像，为解析基因调控提供了可能。

实验参数考量

成功的CRISPR活细胞成像依赖于对多个关键参数的综合优化。

1. 图像质量 : 图像质量是所有分析的基础，信噪比（SNR）是其金标准。高SNR能提升定位精度。文章澄清了领域内长期存在的将SNR与信号背景比（Signal-to-Background Ratio，SBR）、信号背景噪声比（Signal-to-Background-Noise Ratio, SBN) 等概念混淆，指出SNR是评价成像质量的根本指标。文章指出了一个常被忽略的要点：噪声不仅来自背景，也来自信号本身（泊松噪声），一个严谨的SNR计算必须考虑所有噪声源。

2. 探针设计与递送: 探针和递送策略从源头决定实验成败。gRNA效率主要取决于探针数量和染色质可及性。在递送策略上，体外预组装RNP并递送的方法（如Oligo-LiveFISH）相比构建稳定细胞系，具有更高的灵活性和更广的应用范围，尤其在原代细胞等难处理体系中优势显著。

3. 多重性与特异性: 为了实现多色成像，直接标记sgRNA比使用有限的正交Cas系统更具优势。同时，特异性是CRISPR成像的关键考量，需通过FISH等方法对脱靶效应等进行严格验证。

4. 显微镜选择: 文章对比了多种DNA活细胞成像平台：宽场 (Wide-field) 显微镜易于操作，但是背景高且缺乏Z轴信息；共聚焦显微镜能有效去除焦外光，其中转盘式共聚焦 (Spinning disk confocal microscopy) 速度更快，适合活细胞成像；光片（ Light-sheet）显微镜光毒性极低，适合厚样本成像。此外还有将分辨率提升到~100 nm的Structured illumination microscopy (SIM)以及纳米精度的MINFLUX。

传统光学显微镜的空间分辨率受限于衍射极限（diffraction limit ，~250纳米）。然而，基因位点这样的稀疏分布的发光体的成像可近似为一个由点扩散函数（PSF）决定的光斑。通过将其测量强度分布拟合为合适的函数（如二维高斯函数），在收集到足够光子数的情况下可将定位精度提升至10-20纳米，显著小于衍射极限。这种方法被称为超定位（super-localization）显微技术。

传统的二维成像技术在研究三维的生命活动时存在局限。将三维空间分布投影到二维平面会丢失关键的空间和动态信息。三维超定位显微镜，比如Moerner组开发的双螺旋点扩散函数（Double-Helix Point Spread Function，DHPSF）显微镜，通过工程化PSF来编码轴向信息，实现高精度的三维动态追踪。

实验的时间分辨率必须与所研究的生物过程的时间尺度相匹配。这需要在空间分辨率、时间分辨率和成像总时长之间做出权衡，以在保证信噪比的同时，最小化光毒性和光漂白。

定量图像分析

为了从动态成像数据中提取生物学信息，必须进行严谨的定量图像分析。这种基于单粒子追踪（Single Particle Tracking，SPT）的分析流程第一步是轨迹构建：首先是定位（Localization），通过高斯拟合等算法，精确确定每一帧中荧光标记位点的坐标；其次是追踪（Tracking），利用算法连接跨帧的定位点，构建出位点的运动轨迹。基于轨迹，即可运用物理学模型提取关键动态参数。比如通过计算两点间距离，观察染色质环形成等构象动态。

（一）单点动力学分析:

均方位移（Mean Square Displacement, MSD）是表征运动模式的核心指标。通过分析其与时间延迟 τ 的关系(MSD( τ ) ~ τ α)可区分不同运动类型：完全随机的布朗运动（Brownian Motion, α=1），存在主动力量推动的超扩散（Superdiffusion, α>1），运动受限的亚扩散（Subdiffusion, α<1）。多数研究表明，染色质的亚扩散行为与分数布朗运动（fractional Brownian motion，fBm）模型吻合。这可能源于聚合物链的内在弹性和拥挤细胞核的粘滞性。速度自相关（Velocity Autocorrelation， VAC）用于分析粒子运动的时间相关性。染色质运动的VAC通常呈负相关，这反映了聚合物链的粘弹性和回复力。

（二）多点耦合动力学分析：

此分析旨在揭示不同位点间的协同作用。均方距离变化（Mean Square Change in Distance, MSCD）通过描述两点间的相对运动，能有效消除整体漂移带来的噪音。速度互相关（Velocity Cross Correlation，VCC）是量化两个位点间动态耦合的工具。通过将实验VCC数据与Rouse聚合物模型拟合，可以提取应力在染色质链上的传播时间（Rouse弛豫时间）。文章还讨论了隐马尔可夫模型（HMM）等工具。

定位误差不可避免，主要源于静态误差（光子数有限；光子数越少，定位精度越低）和动态误差（曝光期间分子运动，活细胞成像中尤为突出）。这些误差可导致对分子间距离的错误估计。例如模拟显示，实际距离< 50 nm的增强子-启动子对，其表观测量距离可为150-300 nm。此外，标记物与功能位点间的距离也是误差来源。因此，解释数据时必须审慎评估和校正定位误差，以确保结论的准确性。文章给出了包含校正项的fBm模型下的MSD表达式。

从工具到生物学问题

凭借先进的CRISPR成像工具，我们正以前所未有的时空分辨率探索核心生物学问题。

在染色质组织与通讯层面，Oligo-LiveFISH揭示了染色质存在着短程“一维顺式通讯”和长程“三维反式通讯”两种信息传递模式。

在DNA损伤与修复领域，LiveFISH和fCRISPR等技术实现了实时追踪损伤位点上修复因子（如53BP1）的招募与解离，直击修复的第一现场。

关于增强子-启动子互作与转录的关系，亓磊（Oligo-LiveFISH），Thomas Gregor和陈宝惠（TriTag）等实验室的发现表明转录过程伴随着对染色质运动的“限制”。但也有研究发现转录反而会增加其动态性。要解决此争议，高分辨率同步追踪染色质和新生RNA将是关键。

总之，CRISPR活细胞成像技术通过实现对非重复基因组和内源RNA的动态观测，正推动整个领域从静态描述向动态机制研究发生深刻的范式转变。

展望未来，将CRISPR成像与CRISPRa/i、表观遗传编辑等“扰动”技术相结合，将能建立起三维基因组动态、基因调控与疾病之间的因果关系。其最终目标是解码基因调控的空间逻辑，加速在免疫学, 肿瘤学, 神经生物学等领域的治疗性突破，并拓展其临床诊断潜力。

本文第一作者朱彦宇博士为斯坦福大学生物工程系博士后，本科毕业于北京大学化学与分子工程学院，博士毕业于威斯康星麦迪逊大学化学系物理化学专业。通讯作者为斯坦福大学生物工程系的亓磊教授和斯坦福大学化学系的W.E.Moerner教授。亓磊教授课题组开发了广泛使用的基于CRISPR的基因调控 (CRISPR a/i)，基因组三维结构调控 (CRISPR-GO) 和基因组成像 (LiveFISH, Oligo-LiveFISH) 的工具等。这些工作从最初的 DNA 成像工具开发，到能够观测原代细胞DNA的 LiveFISH ，再到能观测非重复序列的高分辨率 的Oligo-LiveFISH，开启了活细胞内观察基因组动力学的新纪元。W.E.Moerner教授在单分子光谱学和超分辨率荧光显微镜领域具有开创性贡献。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41576-026-00949-z

制版人： 十一

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