Nature | 体内生成CAR-T的新方法

撰文 |章台柳

CAR-T细胞是目前治疗血液系统恶性肿瘤的极具前景的方法，FDA已经批准 7 种CAR - T细胞疗法。但标准CAR-T制作流程复杂，涉及从患者外周血中分离和富集T细胞、T细胞活化、使用病毒系统转染CAR基因、体外CAR-T细胞扩增、CAR-T细胞质控、冷冻保存以及回输，整个制造周期一般需要2 -4 周，具有产品质量不均一、生产周期长、成本高昂等缺点。CAR通常需要逆转录病毒载体递送，并随机整合到基因组，会产生表达的异质性。利用CRISPR - Cas 9 和AAV介导的同源定向修复（HDR），将CAR整合至内源性 人TCRα恒定区 （ TRAC ）基因位点，这种 TRAC 整合型CAR - T细胞可呈现动态CAR表达模式，延缓T细胞耗竭，并在异种移植与免疫缺陷模型中改善肿瘤控制效果。这也为开发同种异体CAR-T细胞疗法奠定了关键基础：CAR插入后会破坏内源性TCR，可预防移植物抗宿主病。目前，使用健康供体或诱导多能干细胞（iPSC）来源的同种异体TRAC - CAR-T细胞的临床试验中，已在淋巴细胞预清除的血液系统恶性肿瘤患者中获得完全缓解。同种异体疗法可通过使用健康供体来源的“off - the - shelf”产品，解决生产限制问题；然而，同种异体CAR-T细胞最终仍会被宿主排斥，且频繁出现疾病复发。

体内直接生成 CAR-T 细胞有望克服白血病相关的体外制备瓶颈，同时还能促进分化程度更低的 CAR-T 细胞生成，这类细胞与改善的体内抗肿瘤活性相关。迄今为止，为在体内生成 CAR-T 细胞，研究者已尝试使用随机整合病毒载体（组成型CAR表达）或非病毒载体（ LNPs ，导致瞬时 CAR 表达），两种方法均在非人灵长类动物和人体中得到验证，且近期已进入 I 期临床试验。然而，这些方法面临诸多挑战，包括治疗剂量下的编辑效率不足、脱靶效应风险；同时， CAR 的递送与表达需具备 T 细胞特异性，否则向造血干细胞（ HSC ）的脱靶编辑可能导致转化性突变，而CAR在肿瘤细胞中表达则可能阻碍CAR靶标在细胞表面的呈现，进而引发抗原阴性复发。采用LNPs递送 CAR mRNA 可实现瞬时 CAR 表达，这避免了插入突变或 CAR 在肿瘤细胞中稳定表达的风险，但其所需剂量尚不明确。慢病毒载体的包膜可经工程化改造以提高对 T 细胞的特异性，但任何被转导的非 T 细胞同样会表达 CAR （除非使用谱系特异性启动子），并且尽管罕见，仍存在插入突变的潜在风险。那么假设，在体内将无启动子的 CAR 转基因整合至 TRAC 位点，可以实现 T 细胞特异性且生理性的 CAR 表达，同时绕过体外细胞制备的环节。但迄今为止，在人体 T 细胞中实现大片段 DNA 的体内定点整合仍难以实现。

近日 ，来自 UCSF的 Justin Eyquem 团队 在 Nature 杂 志上发表文章 In vivo site-specific engineering to reprogram T cells ，展示了通过体内定点整合大片段DNA，可以实现稳定且细胞特异性的转基因表达。开发了一个双载体系统：分别使用包膜递送载体（EDV）递送CRISPR–Cas9核糖核蛋白（RNP），使用腺相关病毒（AAV）递送DNA供体模板。对两种载体进行优化，以提高其对T细胞的特异性递送和基因打靶效率。通过将CAR转基因整合到T细胞特异性位点（TRAC），在B细胞再生障碍、血液系统恶性肿瘤及实体瘤的人源化小鼠模型中，体内生成了达到治疗水平的CAR-T细胞。 这些发现为实现更高效、更精准且更可及的T细胞疗法开辟了新路径。

体内定点整合需要递送Cas 9 和同源定向修复模版。之前的研究显示，工程化包膜递送载体（EDVs）可利用抗体-抗原相互作用，在体内将Cas9核糖核蛋白复合物瞬时且选择性地递送至目标细胞，但在体内实现大片段同源定向修复模板的核内递送仍是一项挑战。AAV6被报道可在体外转导人T细胞、自然杀伤细胞和造血干细胞。研究人员计划用其来递送同源定向修复模板，该模板编码一种无启动子的CD 19 CAR cDNA，其两侧侧翼为自裂解2A肽和截短的表皮生长因子受体。这种设计使得CAR在整合后能够由内源性 TRAC 启动子驱动表达，该启动子具有T细胞特异性。为了生成 TRAC -CAR T细胞，研究人员将靶向 TRAC 的Cas9-EDVs与包装在AAV6中的 TRAC -CD19 CAR同源定向修复模板联合使用。首先在体外评估递送效率。EDVs递送Cas 9- sgRNA的效率较高，即使在最低感染复数下，仅使用EDVs就能实现5 0% 的TCR敲除，证实了先前报道的有效性。将靶向 TRAC 的Cas9-EDVs与递送同源定向修复模版的AAV6联合用于原代T细胞，出现CAR+TCR - 群体，比例约3 9.2% ，表明成功在体外实现 TRAC CAR - T细胞的生成。随后向NSG小鼠移植人PBMCs构建人源化小鼠，静脉注射相关EDVs和AAV 6 ，结果显示小鼠脾脏中约3 % 的T细胞为 TRAC CAR - T细胞，且B细胞再生出现障碍，证明体内生成的靶向CD 19 的 TRAC CAR - T具有功能性。由于MHC - I / II完整的NSG小鼠在移植了人PBMCs后会诱导移植物抗宿主病，进而会激活T细胞，猜测会因此提高敲入效率。MHC - I / II双敲的NSG小鼠对异种移植物抗宿主病具有抵抗，则未检测到 TRAC CAR - T，也没有B细胞再生障碍。即在MHC完整的NSG小鼠中，异种移植物抗宿主病是VSVG-EDV和AAV6介导的敲入所必需的。

虽然在体内生成了 TRAC CAR - T，但效率低下，可能的原因有：(1) AAV对血清中和抗体的敏感性；(2) 缺乏对T淋巴细胞的选择性；(3) 处于增殖状态的T细胞数量有限。为了解决AAV对中和抗体敏感的问题，对AAV 6 衣壳文库进行进化。在有人类血清存在的条件下，将人T细胞与衣壳文库以低感染复数共培养。随后洗涤T细胞，纯化细胞内病毒DNA，并将其克隆到野生型AAV质粒骨架中，以生成用于下一轮进化的衣壳文库。经过三轮感染循环后，利用二代测序对亲代文库和进化后的文库进行分析，鉴定出多个优势变体，其中一种携带氨基酸基序HAPRVEE的变体，其丰度相较于亲代文库富集了约20,000倍。评估进化后的AAV在T细胞中的转导效率，结果显示在血清存在的条件下，AAV 6 在较低感染复数时递送效率受损，而进化后AAV的递送效率没有改变，表明对预先存在的中和抗体具有抗性，且生成的 TRAC CAR - T对肿瘤细胞的杀伤能力没有差异。为了确定调控新进化的AAV变体转导效率的宿主因子，对T细胞进行全基因组CRISPR敲除筛选。结果显示，CD 7 ，一种在T细胞和NK细胞上表达的跨膜受体，是T细胞进化型AAV转导的最关键决定因素。敲除CD 7 显著降低进化变体的转导效率，而对AAV 6 没有影响。将这种在人T细胞上进化且靶向CD7的变体称为AAV-hT7。

第二个障碍是在递送层面缺乏T细胞特异性。为了进一步提高EDV/AAV递送系统的选择性，研究人员通过引入一种与LDLR受体家族亲和力消除的突变型VSVG，并添加了能够同时实现靶向和激活作用的抗CD3单链可变片段，来限制EDV的特异性。评估其对细胞类型的偏好性，发现VSVG / AAV 6 在所有测试的细胞谱系中都实现基因编辑；而AAV-hT 7+ anti - CD 3- EDV的组合将基因编辑限制在CD 4+ 和CD 8+ T细胞中。

第三个障碍是处于增殖状态的T细胞数量有限。研究人员检测anti - CD 3- EDV是否能诱导T细胞活化，结果显示活化标志物CD 25 和CD 69 的表达显著增加，与使用1:10的磁珠与细胞比例的抗CD3/抗CD28 Dynabeads处理的效果相当。即进化的AAV衣壳和抗CD3-EDV共同解决了体内递送所面临的三个既定挑战。

在体内评估 TRAC CAR - T生成效率，结果显示anti - CD 3- EDV + AAV-hT7的组合诱导的CAR T细胞数量显著增多，且CAR整合率最高可达脾脏中所有T细胞的1 9.7% ，且未检测到系统性炎症或细胞因子风暴。对体内生成的 TRAC - CAR T细胞的特征进行分析，未处理小鼠与CAR阴性T细胞之间没有差异。在 TRAC -CAR T 细胞群体中，同时存在CD4 + 和CD8+ T 细胞，且CD4与CD8的比例平衡。此外，Ki -67 的表达更高，存在大量TOX + 群体。这都表明，在体内生成了一种高增殖能力的CAR T细胞群体，该群体保留了记忆标志物，且Treg比例显著降低。

最后，研究人员评估了体内生成的 TRAC CAR - T对B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）、多发性骨髓瘤和肉瘤的抗肿瘤效果。NSG - MHC -1/ II双敲除小鼠接种侵袭性NALM 6 白血病细胞系，3天后注射人PBMC，1天后注射anti - CD 3- EDV + AAV-hT7。单次注射后，来自四个人PBMC供体的20只小鼠中有18只达到了完全缓解。为了与传统CAR - T直接进行抗肿瘤效果的比较，使用同一个人PBMC作为供体，比较体外慢病毒感染产生的CAR - T或慢病毒感染产生的 TRAC CAR - T、anti - CD 3- EDV + AAV-hT7以及慢病毒递送产生的体内CAR - T的治疗效果。结果显示，接受anti - CD 3- EDV + AAV-hT7治疗的小鼠全部实现完全的肿瘤控制，优于其他处理组。而且，anti - CD 3- EDV + AAV-hT7诱导产生的 TRAC CAR - T显示出更高频率的 CD45RA+ CD62L + CD8 + 亚群，这表明其具有幼稚或干细胞记忆表型。所有 TRAC CAR - T细胞均显示出高且均一的CAR表达，反映了由 TRAC 位点特异性整合赋予的均一转录调控。将NSG-MHC-I/II双敲除小鼠植入多发性骨髓瘤细胞系OPM2，然后注射PBMC并进行anti - CD 3- EDV + AAV-hT7（ TRAC - BCMA-CAR）治疗。所有接受治疗的小鼠（8/8）均达到了完全缓解。肿瘤细胞再次攻击后，4只缓解的小鼠中有3只保持了持久的肿瘤控制，表明体内生成的CAR-T细胞具有持久性。将NSG-MHC-I/II双敲除小鼠植入MES - SA肉瘤，然后注射PBMC并进行anti - CD 3- EDV + AAV-hT7（ TRAC - B 7 H 3 -CAR）治疗。在一个供体的6只小鼠中的5只中引发了完全缓解，并在第二个供体的8只小鼠中的3只中引发了完全缓解。这些结果证明了anti - CD 3- EDV + AAV-hT7治疗在血液系统恶性肿瘤之外的应用。即这些数据表明使用双重优化的AAV和EDV可进行体内定点CAR T细胞生成，体内重编程T细胞可针对多种血液系统恶性肿瘤和一种实体瘤模型产生抗肿瘤细胞治疗反应，将体内 TRAC -CAR T 胞生成确立为一个极具前景的治疗平台。

总的来说，研究开发了高效且特异的体内CAR-T生成新方法，且在血液肿瘤和实体瘤中都显示出良好的肿瘤控制能力。

https://www.nature.com/articles/s41586-026-10235-x

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