Genes & Diseases | 胡小晓团队与吴二喜团队开发核酸适体驱动的SARS-CoV-2 N蛋白超灵敏双模式检测平台

撰文丨廖欢

严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）变体由于频繁突变，其传染性、传播性和抗原性不断变化，呈现出持续进化和多样化特征，从而增加了诊断与治疗的复杂性，亟需开发具有高灵敏度和广谱突变适应性的检测平台。尽管逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和免疫测定仍被视为金标准，但其对实验条件和操作环境要求较高。

为了解决这一问题，近期，来自湖南大学的胡小晓副教授的研究团队，联合美国贝勒医学院的Erxi Wu教授，在Genes & Diseases上合作发表了题为Dual-mode aptamer-driven biosensing platform for ultrasensitive and mutation-resilient detection of theSARS-CoV-2nucleocapsid protein的研究论文，报道了一种基于核酸适体,可特异性结合SARS-CoV-2 N蛋白的超灵敏双模式检测平台。这项交叉研究融合了分子生物学技术和纳米技术，实现了对SARS-CoV-2核衣壳（N）蛋白及其突变株的超灵敏和突变适应性检测。

研究团队通过计算机辅助的X-Aptamer SELEX策略及SPR分析技术筛选获得核酸适体NP14。研究团队 通过分子对接、截短和碱基突变实验，揭示了NP14-N蛋白的相互作用。预测结果表明，NP14主要与N端结构域（NTD）内的关键残基相互作用。此外，在NP14结构方面，其二级结构包含两个关键茎环区域 (P1和P2)。圆二色谱证实，NP14采用B型或发夹状DNA结构，而非G-四链体结构，这有助于其高选择性和低非特异性结合。

为评估核酸适体NP14的特异性与识别广谱性，研究团队将其与以下一系列代表性蛋白分别进行结合实验：SARS-CoV-2 N蛋白、SARS冠状病毒N蛋白、人类冠状病毒HCoV-229E、OC43和HKU1的相关蛋白、SARS-CoV-2受体结合结构域（RBD）、甲胎蛋白（AFP）、白细胞介素-4（IL-4）、牛血清白蛋白（BSA）、流感A和B病毒蛋白（Influenza A、Influenza B）。结果显示，NP14与SARS-CoV-2 N蛋白结合具有很强的特异性且结合效率最高。在酶联寡核苷酸检测中，NP14在宽浓度范围内能识别SARS-CoV-2的α、β、γ、δ、λ和奥密克戎（BA.1、BA.2、B.1.640和BA.4）变体，证实其具有良好的广谱识别能力。这些结果表明，NP14是一种具有高度特异性、突变适应性好的探针，能够高效率地检测各种SARS-CoV-2变体。

在前期报道中，研究人员已将适体与抗体夹心方法用于小分子或者蛋白检测具有良好的特异性和较高的灵敏度。因此，本研究团队也开发了一种杂交酶联免疫测定法（ELAAA），并将其与标准的双抗体夹心ELISA进行了比较。杂交ELAAA的检测限为0.1 ng/mL，而ELISA为0.5 ng/mL。这可能归因于核酸适体的小尺寸和灵活性，减轻了空间位阻，并且避免了仅用抗体形式观察到的轻微交叉反应，从而减少非特异性结合背景，提高检测灵敏度。这些结果验证了在夹心系统中添加核酸适体-抗体可以提高抗原检测的灵敏度和特异性。

基于这些进展，该团队设计了一种多色动态光散射增强杂交酶联免疫测定法（MD-ELAAA），将等离子体比色法与动态光散射（DLS）相结合，实现了肉眼可视化判读与定量分析，进一步采用病毒培养物对该平台进行了一系列评估。它检测到病毒培养物0.43 TCID50/mL，与标准ELISA相比提高了47倍。该MD ELAAA平台通过以下三项创新：（1）其非聚集等离子体传感使用金纳米花（AuNFs）和银沉积化学来提供稳定的多色视觉输出；（2）其双显示模式将快速的肉眼比色信号与光散射强度的精确DLS量化相结合；（3）通过利用NP14的高亲和力和突变体适应性，该系统也能实现对突变体的高效识别。通过将可视化检测与仪器定量分析途径相结合，该MD ELAAA能够可靠地检测出低丰度抗原，兼具即时检测的简便性与实验室级的检测准确性。

研究团队通过广泛的验证实验证实了MD ELAAA检测平台卓越的分析特性。该平台的核心优势在于其检测结果可通过肉眼识别，并且在0.01-5 ng/mL的动态范围内对目标物表现出良好的检测性能。与商业ELISA试剂盒（灵敏度1.4 ng/mL）相比，该MD ELAAA方法的性能优于之前大部分报道的基于核酸适体的检测方法。

综上所述，本研究介绍了一种高亲和力核酸适体NP14，可选择性靶向SARS-CoV-2核衣壳蛋白的保守N端结构域（NTD）。将核酸适体NP14整合到结合比色法和动态光散射的双模式MD ELAAA平台中，使其灵敏度比传统ELISA高47倍，并具有强大的变体适应性检测能力。该研究为新一代高灵敏生物传感器的开发提供了重要思路，兼顾检测的简便性与定量准确性。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.gendis.2025.101943

湖南大学生物学院博士生周舒为文章第一作者，湖南大学生物学院胡小晓副教授和美国贝勒医学院的Erxi Wu教授为本文的共同通讯作者。该项目由湖南省自然科学基金（No. 2023JJ30124）和重庆市自然科学基金（No. CSTB2022NSCQ-MSX1551），福建省自然科学基金（No. 2023J01247）以及广东省自然科学基金项目（No. 2024A1515012771）资助。

制版人：十一

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