【案鉴·创新】| 破解RDC稳定性难题：看N端修饰如何重塑RDC的稳定性和工艺边界？

在肿瘤靶向治疗领域，纳米抗体放射性药物偶联物（RDC）凭借高特异性、强组织穿透性的优势，成为精准诊疗的重要方向；作为新型靶向诊疗试剂，其偶联工艺稳定性直接决定产品质量与临床转化价值。

目前行业主流偶联工艺多依托纳米抗体表面赖氨酸残基连接螯合剂并完成放射性核素标记，但该工艺存在显著痛点：当纳米抗体N端为谷氨酰胺（Gln）且直接偶联螯合剂时，分子稳定性会明显下降，稳定性测试中碎片增多现象突出，部分项目碎片占比甚至超过20%。该问题不仅导致产品纯度难以满足药用要求、增加下游纯化难度与生产能耗，还存在潜在临床安全风险，拖慢项目进度，成为纳米抗体 RDC 产业化与临床落地的重要制约因素。

稳定性是监管绕不开的话题

作为抗体偶联类药物（ADC相关类别），纳米抗体RDC的生产工艺与质量管控，必须严格对标国内外监管机构的规范要求，核心围绕产品纯度、稳定性与安全性三大维度把控。国际层面，美国FDA在《Antibody-Drug Conjugates Guidance for Industry》中明确规定，抗体偶联类药物需严控蛋白碎片等降解产物含量，通过系统性稳定性研究验证杂质控制有效性，保障产品有效期内的均一性与安全性；国内层面，NMPA发布的《生物类似药研发与评价技术指导原则》《放射性药物质量控制指导原则》，不仅要求建立完善的降解杂质管控体系、明确杂质限度标准，更强调工艺优化需遵循“质量源于设计（QbD）”理念，保障工艺稳健性与批次可重复性。

从“被动补救”到“主动抑制”的突破

面对N端Gln偶联后碎片增多的难题，我们团队调整了常规工艺“发现碎片后，被动纯化去除”的补救思路，转而采用“从源头抑制碎片产生”的主动策略，经过多轮实验打磨，最终形成一套可落地、高稳健的优化方案。我们先深度拆解问题核心机理：N端Gln本身具备自发环化特性，极易形成焦谷氨酸（pyro-Gln）；而螯合剂直接偶联会引入空间位阻，破坏N端天然氢键网络，引发N端肽键水解断裂产生碎片，进一步加速降解进程。基于这一机理，我们确立“先转化、再偶联”的核心路径，提前将纳米抗体N端Gln完全转化为pyro-Gln形式，再基于赖氨酸位点完成螯合剂偶联，尽可能地减少碎片产生。

工艺：温和可控 &精准高效

整套工艺落地流程清晰且温和可控：首先对纳米抗体进行预处理，在适宜温度、时间条件下精准孵育，让N端Gln实现高效转化（转化率≥95%），并通过质谱严格核验转化效果，全程采用温和条件。既借鉴焦谷氨酸翻译后修饰原理，又避免蛋白变性失活；规避不稳定的N端偶联位点，转而选择纳米抗体其它暴露的赖氨酸残基进行偶联；最后通过常规UF/DF一步纯化，快速去除未偶联螯合剂与溶剂残留，满足产品纯度要求。

核心数据对比：优化工艺稳定性优势显著

我们以同一纳米抗体RDC项目为样本，同步开展传统氨基偶联工艺与优化后pyro-Gln转化+赖氨酸偶联工艺的对照实验，并通过稳定性测试+SEC检测确定RDC分子稳定性。

传统工艺偶联后T0样品即出现碎片，占比1.4%；优化工艺后的T0样品中几乎观察不到任何碎片产生。

在25℃条件下传统工艺稳定性测试7天碎片占比升至2.5%，14天达到4.8%；而使用优化后的工艺即使14天后仍然几乎观察不到任何碎片，稳定性显著提升。在35℃条件下，传统氨基偶联工艺稳定性测试7天和14天碎片占比分别为4.1%和8.5%，而使用优化后工艺的偶联样品，碎片检测结果为“未检出”。

【工艺优势】

相较于氨基偶联传统工艺，该策略优势显著：

1）从源头阻断碎片生成，避免了后续高成本、多步骤的纯化工艺，缩短生产周期，明显改善产品质量；

2）工艺条件温和，不破坏纳米抗体抗原结合活性，操作简洁、条件易控。契合 QbD 理念与规模化生产要求；

3）可直接兼容现有生物制药生产线，无需大规模设备改造；

4）通用性强，可适配不同靶点、不同序列的纳米抗体 RDC 开发。

参考文献

1.Steelandt S, et al. Nanobodies: Chemical Functionalization Strategies and Intracellular Applications. Angew Chem Int Ed Engl. 2018;57(9):2314-2335. doi:10.1002/anie.201709762

2.Liu YL, et al. Investigation of N-terminal glutamate cyclization of recombinant monoclonal antibody in formulation development. J Pharm Biomed Anal. 2006;42(2):227-234. doi:10.1016/j.jpba.2006.05.008

3.U.S. Department of Health and Human Services. Clinical Pharmacology Considerations for Antibody-Drug Conjugates Guidance for Industry. 2024.

4.国家药品监督管理局. 生物类似药研发与评价技术指导原则. 2021.

5.国家药品监督管理局. 放射性药物质量控制指导原则. 2022.

关于凯莱英生物
AsymBio

凯莱英生物是凯莱英医药集团（股票代码：002821.SZ/6821.HK）战略新兴业务，聚焦于生物药CDMO服务。凭借先进的技术平台以及丰富的项目经验，为全球客户提供各类新型偶联药物、抗体和重组蛋白药物等一站式CDMO解决方案，具备早期研发、工艺开发、毒理批次、临床批次和商业化批次生产的端到端服务能力。凯莱英生物致力于成为全球生物药客户值得信赖的合作伙伴，赋能全球生物医药创新，加速药品上市进程。更多信息，请访问：www.asymbio.com.cn