Protein & Cell | Arpin抑制Arp2/3复合物的结构基础

细胞迁移作为一种基本的细胞行为，依赖于肌动蛋白骨架的动态重塑来实现延伸、转向等关键动作。肌动蛋白纤维的分支化能够显著影响骨架形态，而这种分支节点是围绕Arp2/3复合物来形成的。Arp2/3的分支作用需要受到核化促进因子（NPFs）的活化，以及内源性抑制蛋白的精细调控。Arpin是一种进化上高度保守的Arp2/3抑制因子，定位于片状伪足前缘，可通过其C端酸性尾部与Arp2/3结合，从而抑制细胞迁移。然而，关于Arpin与Arp2/3的结合方式及其抑制机制，现有研究结论存在不一致的实验证明，并且缺乏高分辨率结构数据的支持。此前的小角散射等研究确认Arpin整体呈现蝌蚪状的构型，由一个N端的球状结构域和C端的柔性尾部组成。但是C端尾部本身就具备一定的抑制活性，突显了我们对于Arpin N端球状结构域功能的认知空白。

近日，北京航空航天大学团队在Protein & Cell上发表了文章Structural basis of Arpin homodimerization reveals cooperative inhibition of the Arp2/3 complex through dual-site engagement。本研究解析了Arpin N端球状结构域1.65 Å分辨率的晶体结构，首次揭示Arpin可以借由该球状结构域的相互作用形成一种稳定的同源二聚体。

Arpin二聚体采取了伪二重旋转对称的构成方式，二聚化界面在物种间高度保守，说明该二聚化很可能对Arpin的生理功能有着重要的作用。进一步的SEC和AUC实验表明，人源和斑马鱼Arpin在溶液中均可形成可逆的二聚体状态，说明该二聚体不够稳定，易于解聚。通过对二聚化界面的结构分析，鉴定出了两个维持二聚化的关键残基Phe95和Met97。对它们的双点突变（F95A/M97A）会显著削弱Arpin与Arp2/3的结合能力，同时在细胞实验中表现出对于片状伪足分支形成的抑制力下降，细胞迁移的定向性下降。这些结构和功能的实验语气表明，Arpin的抑制作用在一定程度上依赖于二聚化所带来的协同效应。

为了进一步验证二聚化对于Arpin功能的重要性，同时也是为了探索以其他分子替代Arpin作用的可能性，我们构建了多种工程化二聚体形式。其一是融合GST与Arpin的C端尾部（GST-aCT），使之通过GST来形成更为稳定的二聚体；其二是直接通过化学交联作用将两个Arpin C端尾部的N端连接在一起，形成固定的最小化双尾多肽（D-aCT）。两者均在实验中表现出比天然Arpin更强的Arp2/3结合能力，说明二聚化的协同作用是存在的。进一步地，我们利用基于三维扩散模型的AI设计算法CUTEDGE对Arpin的C端尾部进行了重新设计。该设计的挑战在于C端尾部与Arp2/3的两个结合位点是不同的，也就是需要同时针对两个靶点进行结合多肽的设计。最终，在设计得到的多肽中，双尾多肽dP_arpin_0548与Arp2/3有着比天然Arpin更高的结合力，提高了约20倍。

综合上述研究结果，以及此前在低分辨率电镜结构研究中观察到的Arp2/3上可能存在两个Arpin结合位点的证据，提出一个Arpin与Arp2/3的2:1结合模型：Arpin通过同源二聚化，使两条C端酸性尾部同时占据Arp2/3上的两个结合位点，从而实现正向协同抑制，提高结合稳定性和抑制活性。研究团队将这一机制概括为“蝴蝶模型”。在该模型中，两个N端结构域如同蝴蝶双翼，C端尾部向外延伸，如同蝴蝶的后翅尾突，它们分别结合Arp2/3上的两个位点，形成了稳定的抑制复合物。

本研究揭示了Arpin抑制Arp2/3复合物的结构基础，阐明同源二聚化在正协同抑制中的关键作用，深化了我们对于细胞迁移的理解。同时，在癌症诊疗中具有极大危害的肿瘤转移正是一种失控的细胞迁移，本研究基于Arpin二聚体设计的双尾肽将为抗肿瘤转移的药物研究提供全新的思路与分子工具。

原文链接：https://doi.org/10.1093/procel/pwag021

制版人： 十一

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