稳定细胞株开发时间线的工业界视角

将生物药推向临床进行首次人体（FIH）研究是一个漫长且复杂的过程。CMC开发的第一步是构建表达治疗性蛋白的细胞系，细胞系开发（CLD）处于整个开发时间线的关键路径上。

随着人们对FIH候选药物的关注，尽快将药物推向市场的需求日益迫切，这也引出了一个核心问题：何时能获得可用稳定细胞株？生物制药行业CLD工作组开展了相关调查。

在典型平台工艺中，CLD始于DNA表达载体（或质粒）的构建，最终确定候选克隆。候选克隆的选择基于最适配的CMC特性，通常包括细胞培养生长情况、生产力、细胞系稳定性以及表达治疗性蛋白的目标产品质量。为统一调查标准，本研究将冷冻保存的候选细胞称为研究细胞库（RCB），调查重点聚焦于RCB的开发过程，而非从RCB种子库制备MCB所需的时间和工作量。

调查设计的一个核心考量是区分标准单抗（mAb）与复杂分子的开发差异。复杂分子是除标准抗体外所有其他生物药的统称（如双特异性/多特异性抗体、抗体片段、蛋白融合体和糖蛋白）。因此，调查分为两部分，分别针对单抗和复杂分子设置问题。本文重点阐述抗体表达细胞系的开发时间与工作量，仅在受访者指出蛋白类型对某一流程步骤的时长或是否纳入有显著影响时，才对复杂分子进行区分说明。95%（19家）的工作组成员使用CHO细胞作为宿主细胞，68%（19家）使用随机整合载体，这些工艺变量构成了调查结果解读的基线。

调查按 CLD 的典型阶段分为三部分：（ 1 ）转染前阶段，包括表达载体构建；（ 2 ）转染群（ pool ）构建阶段；（ 3 ）从转染群中筛选候选克隆并开发 RCB 阶段。 这三个阶段均为独立操作单元，具有明确的节点交付物（如表达载体、细胞群、克隆细胞库）。其中克隆筛选阶段包含两个不同环节：单细胞克隆形成，以及克隆在平板、摇瓶和 / 或小规模生物反应器中的扩增，直至 RCB 构建完成。小规模扩增是从单细胞克隆到首次冷冻保存细胞库（称为前 RCB 或安全库）的连续过程，随后从表现最优的克隆中筛选并保存为 RCB 。

这三个阶段的明确节点使得FIH开发项目可根据需要暂停，但可能导致进度中断。本文将分别阐述三个阶段的独立时间线，汇总后即可得到从DNA序列到候选克隆筛选的典型时间线（排除流程中断情况）。鉴于参与调查的工业企业数量多、类型全，本文汇总的结果可视为整个生物制药行业的高度代表性数据。

转染前阶段

FIH开发项目的转染前阶段，以细胞系开发（CLD）团队收到候选药物的DNA序列为起点。多数FIH生物药为单抗。

从DNA序列到完成转染前准备的流程较为复杂，涵盖CLD团队（或支持团队）的内部操作，以及外包给合同实验室的外部工作，且抗体与复杂分子的该流程基本一致（如下图）。

流程始于企业内部开展的成药性评估，调查未明确评估具体内容，但研究团队认为其核心包括：分析蛋白质一级序列以识别CMC风险因素（如易脱酰胺位点等问题氨基酸残基）、蛋白质的快速小规模表达，以及表征可能影响成药性的理化性质。这类评估通常在稳定细胞系构建所需的基因和质粒设计启动前完成，因此未计入CLD转染前阶段的耗时。

尽管不同企业在载体构建中使用的DNA序列元件（如启动子、筛选标记、信号序列等）存在差异，但行业内的核心关注点一致。82%的受访者会利用计算机模拟进行质粒设计，以简化DNA克隆流程并提升基因表达效率（如密码子优化）。对于单克隆抗体，78%的受访者选择在同一质粒/载体中表达重链和轻链多肽；而复杂分子的表达策略则因项目而异。研究团队认为，复杂分子采用多质粒表达可能更具优势，可通过调节链比例提升分子质量。

载体设计完成后，几乎所有受访者都会将蛋白质编码区的基因合成工作外包。调查显示，基因合成的典型周转时间为3周（30%）或4周及以上（39%），这一周期可能受地缘政治因素影响——部分受访者提到，国际运输和海关流程可能导致收货延迟。复杂分子的基因合成周转时间结果相近，且该环节耗时在转染前阶段的总预算时间中占比显著。多数受访者表示，基因与质粒设计、基因合成、质粒/宿主细胞制备等所有转染前相关活动合计耗时4-6周，可见DNA合成等待是该阶段推进至下一环节的主要瓶颈。

转染前阶段的工作量主要取决于每个开发项目的候选分子数量。在抗体开发中，一个“分子”指能识别特定靶点的重链与轻链多肽序列的独特组合。74%的受访企业会为单个靶点开发多个分子，但61%的受访者为每个抗体分子仅设计一种包含信号肽的编码序列。而复杂分子的这一比例降至38%。表达载体骨架的设计也呈现类似趋势：70%的受访者为抗体转染开发单一质粒变体，复杂分子的这一比例仅为44%。相比之下，单克隆抗体的载体设计经验可在不同项目间快速迁移，而复杂分子通过增加编码序列和载体变体数量，能降低表达过程中的不确定性风险。

表达质粒的实际构建工作量取决于设计方案（各企业差异较大，未纳入调查）。受访者确认质粒组装正确性的主要方法是对抗体构建体的重链和轻链基因进行DNA测序。在加速时间线这一场景下，DNA测序可与转染启动并行开展，但会增加项目风险。若每个分子需构建并验证多个质粒，会显著增加质粒设计/构建阶段的工作量，并延长后续转染阶段的耗时。企业选择开发多个表达质粒，本质是为了降低新转染群构建的不确定性——在未开展实验前，难以预测新抗体在稳定细胞系中的表达效果。但成熟的CLD平台在抗体生产中通常能在预期时间内实现稳定结果，而复杂分子则需要投入更多精力，其开发时间线也需相应延长。

转染前需完成表达载体和宿主细胞的准备工作，包括质粒线性化（耗时数天）。宿主细胞需在转染前进行培养，核心关注因素是细胞代次。多数受访者认为宿主细胞的制备方式会影响转染效果，并明确了转染前的最大培养代次标准，通常为10-20代。宿主细胞的解冻与培养可与载体构建阶段并行开展，因此不会额外增加总时间线。

转染阶段

该阶段的核心是将目的异源基因（GOI）导入宿主细胞，并筛选出稳定表达目的基因的细胞群，其耗时与工作量是主要关注重点。生物制药行业普遍采用CHO细胞作为表达宿主，核心优势包括：能耐受严苛的开发流程、在化学成分明确的悬浮培养中生长稳健、易于进行稳定的基因操作、抗病毒感染能力强，且能产生具有类人翻译后修饰的治疗性蛋白，同时获得各国监管机构的广泛认可。

多数企业将表达载体转染作为细胞系开发时间线的起点，这一节点定义清晰，主要依赖CLD团队的工作，且有明确的阶段交付物（如冷冻保存的细胞群库），因此成为不同企业CLD平台时间线对比的重要基准。由于开发流程可在细胞群冷冻保存后暂停，或直接推进至细胞克隆阶段，本调查仅聚焦细胞群构建的时间线，单细胞克隆启动至候选克隆筛选的相关内容则纳入下一部分讨论，包括两阶段过渡中的影响因素。

转染方法与细胞恢复

行业主流转染方法为电穿孔（抗体开发84%，复杂分子开发85%）和脂质体介导转染（脂质转染）。

转染后细胞需在无筛选压力的培养基中恢复1-2天，再进入筛选阶段，确保细胞生长状态良好后耐受筛选压力。

部分企业会设置转染有效性对照（如无DNA的模拟转染、已知特性的标准抗体或荧光蛋白转染），也有企业基于风险评估省略对照，具体取决于既往转染效率数据。

细胞群构建的工作量与风险控制

几乎所有受访者都会为每个表达分子构建多个细胞群，且多数在同一实验中设置6个及以上重复。

增加重复虽会提升工作量，但不影响时间线（细胞群恢复与筛选受生长速率主导，同一分子、同一载体的细胞群生长速率相近），可降低因细胞群丢失（如恢复不佳、泄漏、污染等）导致的转染重复风险，进而避免时间线延长；同时，重复构建可能产生表达表型略有差异的细胞群，为后续应用提供更多选择。

其他影响因素包括：使用不同表达载体骨架、编码序列（如密码子优化序列）或宿主细胞，这些选择主要为提升后续细胞系性能/质量（尤其复杂分子），对时间线影响较小，但会增加CLD团队的构建工作量和分析团队的检测工作量；连续转染（通过超转染提高转基因拷贝数和蛋白表达量）会延长细胞群构建时间，但仅1家受访者常规采用该方式。

筛选压力与细胞群类型选择

所有受访者都会在转染后施加筛选压力，主流方式为营养缺陷型细胞的营养剥夺筛选或抗性基因的抗生素筛选。复杂分子开发中抗生素筛选应用更广泛，可能与多亚基独立载体表达或新型细胞系使用相关。若转染多个含不同筛选标记的载体，通常并行施加筛选压力，不额外延长时间。

谷氨酰胺合成酶（GS）缺陷型或二氢叶酸还原酶（DHFR）缺陷型CHO细胞，常通过甲硫氨酸亚砜亚胺（MSX）或甲氨蝶呤（MTX）增强筛选压力，但89%的抗体开发受访者、100%的复杂分子开发受访者不会在细胞群表征或克隆前进行扩增（通过逐步提高筛选剂浓度提升克隆筛选严格度）。现代CLD平台无需依赖扩增即可达到FIH开发所需的滴度，且扩增会延长时间线、增加突变或细胞系不稳定性风险。

细胞群类型分为bulk pool（大容量群）和mini pool（小容量群），主流选择为大容量群（抗体59%，复杂分子52%），部分企业根据项目需求灵活选择；小容量群构建更耗时（恢复、筛选、放大流程更复杂），但适用于克隆优势明显、大容量群多样性降低的平台，有助于筛选高表达克隆。

细胞群表征与克隆启动时机

时间线差异

细胞群筛选阶段通常耗时2-3周，抗体细胞群在筛选后、克隆前的表征时间也为2-3周，多数企业会先评估细胞群的生长和活力再推进克隆。

复杂分子的克隆启动时间略长，且克隆后对生产力和产品质量的表征需求显著高于抗体，主要因复杂分子表达难度更高。

表征策略选择

抗体细胞群的表征可在克隆前、克隆中或克隆后进行，受访者选择较为平均；而61%的受访者会在克隆前表征复杂分子细胞群，与复杂分子的表达挑战相契合。

从转染到大容量群克隆启动的总时间，超半数受访者报告为3-4周（抗体与复杂分子相近），其余受访者耗时或长或短；小容量群的克隆启动时间更长（尤其复杂分子），但因应用率较低，仅48%受访者回应相关问题。

细胞群的额外应用

转染细胞群除作为单细胞克隆的细胞来源外，还具有多重用途：用于平台生产工艺测试以识别需改进的挑战、放大至大型生物反应器生产工艺中间体（如纯化开发用粗品）、提供平台纯化蛋白用于早期分析方法和制剂开发。部分企业（16%）会将细胞群纯化蛋白用于临床前毒理研究，但无企业将其用于标准开发项目的I期临床试验。特殊场景下（如新冠中和抗体开发），稳定细胞群曾被用于生产I/II期临床试验用物料，以加速紧急临床应用的GMP级原料药供应，为未来标准CLD程序的加速提供了参考。需注意，细胞群用于开发和毒性研究的蛋白生产可能与CLD活动并行开展，不直接影响克隆筛选。

单克隆筛选阶段

单细胞克隆与候选克隆筛选阶段通过小规模细胞培养与发酵技术无缝衔接，核心是从转染细胞群出发，经生产性能与稳定性评估，筛选出最优克隆，是CLD流程中耗时最长、工作量最大的环节——需将数千个候选细胞逐步缩减至单个核心生产细胞系，行业内该阶段的目标高度一致：从转染细胞群中筛选出最适合生物生产的克隆源性细胞系。

克隆启动与细胞群预处理

所有受访者在抗体或复杂分子开发的标准CLD项目中均执行单细胞克隆，符合监管要求（重组产品的细胞基质需源自单个细胞祖细胞）。

多数企业会在克隆前或克隆过程中表征转染细胞群（如批次/补料批次培养的生产力评估、生长/活力/滴度/产品质量分析），复杂分子的表征比例更高（75%vs抗体50%）。抗体开发中部分企业会“风险克隆”（不预先表征细胞群），可缩短时间（转染后3-4周启动克隆），而复杂分子因缺乏成熟平台经验，极少采用该方式。

克隆细胞源自多个重复转染细胞群（100%），且不混合使用（80%），优先选择大容量群（74%）；细胞群需具备高活力，但无明确生长速率要求。20%的企业会在克隆前对细胞群进行分选以富集高表达细胞，42%在克隆过程中识别高生产者。

单细胞克隆技术与设备

行业主流克隆设备为Beacon（38%）和单细胞打印设备（27%），其余企业采用流式细胞分选等其他技术，复杂分子的设备选择比例与抗体相近。部分设备可在克隆或初期扩增阶段识别高表达细胞，其余企业则在后续克隆扩增中进行滴度筛选。

77%的企业已建立克隆源性概率标准，62%对克隆设备进行了验证；96%通过成像监测单个细胞的集落生长（第0天及以后），常用设备包括Beacon（38%）、CELLAVISTA（27%）、Cell Metric（19%）等，复杂分子与抗体的成像要求完全一致，是克隆源性评估的关键步骤。

克隆培养与扩增

克隆容器以96孔板（50%）和384孔板（25%）为主，其余采用纳米笔/纳米孔（多搭配Beacon或Cell Celector设备）；多数企业不使用特殊结合剂处理培养板，但会采用含补充剂、条件培养基或生长因子的专用克隆培养基，以提升集落生长率（培养基成分直接影响克隆效率）。

克隆板筛选的核心标准为生长、生产力和克隆源性，多数企业不筛查产品质量。超过半数企业仅对50个及以下候选克隆进行克隆源性图像复核，通常在克隆数量缩减至可管理范围后开展。

单个分子的克隆接种孔数差异较大（46%接种≤2000孔，54%接种4000-10000+孔），抗体的克隆效率普遍高于复杂分子；克隆扩增需逐步扩大容器规模，从静态培养过渡到振荡培养（悬浮培养），多数企业会经历1-2个静态筛选步骤，过渡至振荡培养的中位时间为克隆启动后3周，振荡培养中位时长8-9周。

候选克隆筛选与细胞库构建

筛选方法与关键评估

几乎所有企业使用小型受控生物反应器（如AMBR15/250）评估工艺性能（滴度）和产品质量，作为候选克隆筛选的核心方法；部分企业已开始应用下一代测序（NGS）进行细胞系表征，未来应用有望扩大。

克隆筛选参数包括生长、生产力、克隆源性和产品质量（多数企业纳入），稳定性评估多在候选克隆筛选前进行（77%），仅约1/3在研究细胞库（RCB）构建前开展——延迟稳定性研究可并行推进其他活动，加速整体时间线，非随机整合技术也可降低该策略的风险。

时间线与细胞库构建

从单细胞克隆到RCB冷冻的时间跨度差异显著（4-5周至20周以上），37%的企业耗时＜12周，47%在12-17周，16%＞20周。为降低风险，多数企业会在克隆启动后4-9周构建预RCB，以便后续筛选中断时恢复流程。

每个分子通常冷冻5-6个克隆作为RCB，每克隆冻存11-30支；抗体开发从单细胞克隆到RCB的中位人力投入为1.5个全职等效岗位（FTE），复杂分子的人力需求更高。

抗体从单细胞克隆到最终候选克隆筛选的中位时间为17-20周，复杂分子略长，两者的核心单元操作一致（均包括发酵评估、产品质量分析、RCB制备等），差异主要源于各平台的小规模克隆扩增与筛选方法不同。

最后

尽管各企业均以创建高表达克隆源性细胞系为共同目标，但采用的方法存在差异。本文通过调查，梳理出建立GMP级生产细胞系的核心共性，明确了典型CLD项目的流程框架。

典型CLD流程始于分子的内部成药性评估，可明确单抗或复杂分子的适配性，并为重组蛋白表达的分子工程提供指导。

12%的受访者已使用建模方法辅助克隆筛选，54%计划未来应用；计算机模拟设计编码序列可降低抗体聚集倾向、改善CMC特性，未来将更受关注以降低分子选择风险、减少克隆开发返工。

表达质粒构建可拆分给内部资源与外部服务商（如CRO），转染前需确认载体核苷酸序列；转染与序列确认可并行开展以加速项目，基因与质粒设计构建总耗时4-8周以上，核心瓶颈为外部基因合成，理想情况下4周可完成全流程。

多数企业将转染作为CLD时间线起点，质粒构建完成后按平台流程转染，细胞恢复与筛选需2-3周，达到适宜活力后推进至下一阶段。

抗体开发中，细胞群表征（前/中/不表征）的选择各占约1/3；复杂分子开发中，更多企业选择克隆前表征细胞群以降低风险（但延长时间）；直接启动克隆的企业，转染至克隆启动的典型时间为3-4周。

多数项目每个靶点仅推进1个分子至克隆阶段，若启动多个分子，通常在研究细胞库（RCB）构建前缩减数量（可在培养板、摇瓶或小型生物反应器中完成）。

分子缩减决策需更多临床前评估或克隆表达产物辅助验证；该决策通常不由CLD团队负责，跨团队有效沟通会影响时间线。

单细胞克隆启动后，流程持续推进至细胞库构建，细胞库（预RCB/安全库、RCB）可作为中途暂停节点，降低克隆开发过程中因灾难性损失导致的风险。

首份安全库的构建时间差异较大（最长＞11周），部分企业可提前至4-5周以减少风险；尽管克隆开发与表征方法差异显著，但总耗时与工作量相对一致——单细胞克隆至候选克隆筛选的中位时间为17-20周，每个分子从克隆到RCB构建的中位人力投入为1.5个全职等效岗位（FTE）。

不同企业流程可能存在差异。典型CLD的核心步骤高度一致，包括载体开发、转染群构建、单细胞接种、克隆源性成像、扩增至培养板培养、过渡至悬浮生长、细胞量放大、小型生物反应器中评估克隆生产性能与稳定性，期间通过生长、生产力（后期加入产品质量）筛选逐步缩减克隆数量。

时间线差异主要源于：克隆评估与筛选方法不同、有限数据下决策的风险偏好、决策主体与流程差异。

下一代测序（NGS）等新技术用于细胞系表征，可提升克隆质量；自动化技术的应用能减少工作量，有望加速开发时间线。

从整体时间线范围来看，多数企业的完整CLD流程（从基因到候选克隆）耗时24-28周，整体范围为＜14周至＞46周，差异与单元操作选择相关（如35%在RCB前完成稳定性研究，77%在候选克隆筛选前完成）。

延迟稳定性评估是潜在的加速手段，但会增加风险，具体取决于平台既往经验与管理层风险接受度；细胞生长速率是时间线的关键约束，慢生长抗体克隆的最大等待评估时间不超过2周，复杂分子克隆的等待时间略长。