LRRK2缺乏通过干扰突触修剪加重睡眠剥夺所致小鼠认知障碍

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睡眠障碍和认知功能障碍是神经退行性疾病的特征症状，如路易体痴呆(DLB)和帕金森病(PD)。现有文献表明，单基因PD的罪魁祸首是富含亮氨酸的重复蛋白激酶2(LRRK2)基因的突变。这些突变的帕金森病携带者经常会失眠，这增加了他们患痴呆症的风险。本研究采用LRRK2基因敲除小鼠模型，研究LRRK2缺乏对REM/NREM睡眠和睡眠剥夺所致认知功能障碍的影响及其相关机制。这项研究的发现可能为LRRK2作为睡眠剥夺介导的神经退行性疾病患者认知障碍的靶点提供潜在的治疗意义。

1.LRRK2缺乏对SD前后NREM睡眠的反向影响

我们评估了LRRK2缺乏是否影响REM/NREM睡眠。监测REM和NREM睡眠的变化(图1A，B)。与S-LRRK2-/-组相比，SD-LRRK2-/-组REM睡眠减少，但差异无统计学意义(图1C)。结果显示，与S-LRRK2+/+组相比，S-LRRK2-/-组的非快速眼动睡眠明显减少(图1D)；SD-LRRK2-/-组的非快速眼动睡眠明显增加(图1D)；与S-LRRK2+/+组相比，S-LRRK2-/-组的不眠明显增加(图1E)。这些数据表明，LRRK2缺乏导致NREM睡眠减少；然而，在SD诱导的应激过程中，LRRK2缺乏影响NREM睡眠的调节。

图1 逆转LRRK2缺乏对SD前后NREM睡眠的影响。

2.LRRK2缺乏降低SD后树突状脊椎密度

考虑到睡眠是通过调节突触可塑性和树突棘来平衡的，而SD可能影响树突棘，我们探讨了LRRK2缺乏与SD结合是否影响PFC中树突状结构的形成。用高尔基体染色计算SD后PFC内树突棘的数量(图2A)。与S-LRRK2+/+小鼠相比，SD-LRRK2+/+小鼠的脊柱密度显著下降(图2B)。值得注意的是，在LRRK2缺乏组中也观察到了类似的差异，SD-LRRK2-/-小鼠的脊柱密度显著低于S-LRRK2-/-小鼠(图2B)。此外，与S-LRRK2+/+小鼠相比，S-LRRK2-/-小鼠的脊髓密度显著增加(图2B)。

图2 SD治疗后LRRK2缺乏症致树突状细胞密度下降。

3.LRRK2缺乏加重SD后小胶质细胞活化

随后，作者团队试图解释SD后LRRK2缺陷小鼠所观察到的深刻的突触损伤。由于研究已经证明小胶质细胞参与了脊髓的收缩和消除，我们接下来探索LRRK2缺乏是否会导致S和SD的小胶质细胞状态的转变。我们评估了吞噬标记CD68在小胶质细胞中的表达(图3A)。与S-LRRK2+/+小鼠相比，S-LRRK2-/-小鼠CD68值明显降低(图3B)。令人惊讶的是，与SD-LRRK2+/+组和S-LRRK2-/-小鼠相比，SD-LRRK2-/-组小胶质细胞CD68的表达显著增加(图3B)。上述结果提示，SD后，LRRK2缺乏似乎触发了更大的免疫反应，这可能是SD相关病理生理的重要驱动力。为了验证这种可能性，我们定量了IL-4、IL-6和IL-1β的基因表达。上述这些结果证明，在SD后，特别是在PFC时，LRRK2缺乏可能诱发和加剧恶性神经炎症。

图3 SD后LRRK2缺乏所致的小胶质细胞活化加重。

4.LRRK2缺陷增加睡眠剥夺后小胶质细胞的突触修剪

为了验证SD是否会干扰小胶质细胞介导的突触修剪，我们检测了前额叶皮层（PFC）中被Iba-1阳性细胞吞噬的免疫荧光标记的PSD95+和Vglut1+的表达情况。我们对每个小胶质细胞胞体内PSD95+和VGLUT1+斑点的内化情况进行了定量分析（图4A）。结果显示SD-Lrrk2-/-小鼠小胶质细胞内PSD95+斑点的体积显著增加（图4B）。睡眠剥夺后，SD-Lrrk2-/-组中PSD95+斑点的吞噬量增加（图4B）。与S-Lrrk2+/+小鼠相比，S-Lrrk2-/-小鼠中小胶质细胞对Vglut1的内吞率显著降低（图4C）。

图4 SD后LRRK2缺乏使小胶质细胞突触修剪增加。

5.LRRK2缺失诱发短期记忆异常

为了确定SD是否会影响Lrrk2+/+和Lrrk2-/-小鼠的认知能力，我们进行了恐惧条件反射测试，以评估短期记忆与SD之间的关联（图5A）。在情境测试中，SD-Lrrk2+/+组和S-Lrrk2-/-组的冻结时间均有所减少（图5B）。在线索测试中，S-Lrrk2-/-组和S-Lrrk2+/+组之间在线索回忆记忆方面未观察到统计学差异（图 5C）。

图5 LRRK2缺失诱发短期记忆异常。

结论

总结全文，在本研究中，我们的发现为LRRK2介导的通路在调节SD相关认知障碍的小胶质突触修剪中的生理作用提供了见解。目前的证据也支持这样的假设，即LRRK2活性对于REM/NREM睡眠稳定性和SD相关认知是必不可少的，这是由神经退行性疾病中的小胶质突触细化所介导的。

在该研究中，研究人员使用了赛昂斯大小鼠跑步机（SANS，SA101）和旷场试验箱（SANS，SA215）来进行实验操作。

SA101Pro 大小鼠跑步机

大小鼠跑步机主要用于小鼠、大鼠及其他动物的训练和新陈代谢研究，使用它可以让动物的训练量化更加准确；同时，小动物跑步机又是动物体能、耐力、运动损伤、运动营养药物、运动生理和病理等研究的必要实验设备。

大小鼠跑步机由跑步平台、跑道、刺激模块以及控制器组成。平台可放置多个跑道，容纳多个被试动物，跑道顶部有可开合的盖子，方便取放动物和防止动物逃脱。跑台的核心部件是一条持续滚动的输送带，其表面材料设计有利于动物稳固抓握；操作流程可设置多种刺激方式和多个阶段流程，实现匀速、匀加速、匀减速等运动模式。

SA215 旷场试验箱

旷场实验视频分析系统（open field test）是观察研究实验动物神经精神变化、进入开阔环境后的各种行为，例如动物对新开阔环境的恐惧而主要在周边区域活动，在中央区域活动较少，但动物的探究特性又促使其产生在中央区域活动的动机，也可观察由此而产生的焦虑心理。中枢兴奋药物可以明显增加自主的活动而减少探究行为，一定剂量的抗精神病药物可以减少探究行为而不影响自主活动。