诺奖得主山中伸弥回顾并展望iPSC研究二十年：从发现到多样化应用

编译丨王聪

编辑丨王多鱼

排版丨水成文

2006 年，山中伸弥（Shinya Yamanaka）和他的学生兼助手高桥和利（Kazutoshi Takahashi）在 Cell 期刊发表论文【1】，首次发下只需表达四个因子——Oct3/4、Sox2、c-Myc 和 Klf4，就能从小鼠胚胎或成纤维细胞中诱导出多能干细胞，他们将其命名为诱导多能干细胞（iPSC），这一发现为山中伸弥赢得了 2012 年诺贝尔生理学或医学奖。

这一最初的意外发现迅速改变了全球的干细胞生物学和再生医学，如今，二十年过去了，我们对细胞重编程和多能性的分子机制有了深刻理解。iPSC 技术也不断发展——变得更安全、更高效、更通用，正成为从疾病建模、药物发现到再生疗法及抗衰老研究等广泛应用的基础。

近日，诺贝尔奖得主山中伸弥教授在Cell Stem Cell期刊发表了题为：Two decades of induced pluripotent stem cell research: From discovery to diverse applications 的文章【2】。

在这篇文章中，山中伸弥教授回顾了 iPSC 的科学历程，强调了对重编程理解的关键里程碑，并探讨了 iPSC 不断扩大的临床和社会影响。

“山中博士，请来看看这些细胞。它们看起来像胚胎干细胞（ESC）。”

那是 2005 年的夏天，高桥和利冲进我的办公室宣布了这件事。他将 24 个候选基因——被鉴定为在小鼠胚胎干细胞中高表达——引入了小鼠胚胎成纤维细胞。为了监测重编程，我们改造了这些成纤维细胞，使得它们只有在激活胚胎干细胞（ESC）特异性基因表达时才能在 G418 筛选下存活。在显微镜下，我看到了几个在形态上类似于小鼠胚胎干细胞的克隆。我告诉高桥：“别激动。这很可能是污染。”当然，后来的事实证明，我错了。

2005 年夏天观察到的首批 iPSC 克隆之一

我大约在 2000 年第一次成为独立研究员时，开始认真思考细胞重编程。核移植实验和转录因子介导的细胞命运转换研究表明，分化状态原则上是可以逆转的。然而，多能性——细胞可塑性的最极端形式——是否能仅由确定的因子诱导，这完全不清楚，我当时认为，解决这个问题可能需要数十年之久。

山中伸弥

让我有信心尝试这个实验的想法是，多能性是由一个相对较小的核心调控网络而非数百个独立组件来维持的。胚胎细胞似乎由数量有限的、通过强化反馈回路连接的转录因子所稳定。如果是这样，强制表达正确的组合可能足以重置细胞身份。尽管如此，我们最初并未期望实验会成功。我们最初的计划是使用逆转录病毒 cDNA 文库进行大规模筛选，而 24 因子实验是作为验证我们筛选系统的试点构思的。如果它失败了，我们会继续进行基于文库的无偏倚发现。

高桥重复了实验，并持续获得类似的克隆。通过系统性地剔除，他将基因集缩小到四个——Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc（合成为OSKM）。由这四个因子诱导的细胞表现出多能干细胞的特性。这就是诱导多能干细胞（induced Pluripotent Stem Cell，iPSC）的诞生。

到我们向Cell期刊投稿时，我们已经在实验室确认了 iPSC 诱导的可重复性。然而，我们仍担心其他人使用不同的手法、试剂和设备是否能重复出来。我们的担忧被证明是多余的——在不到一年时间里，世界各地的多个实验室成功利用小鼠和人类细胞生成了 iPSC。胚胎干细胞研究从小鼠过渡到人类用了 17 年，而建立在胚胎干细胞研究基础上的 iPSC 技术仅用 1 年就完成了这一过渡。此后，数千项研究探索了这项技术的几乎每个方面，从分子机制到转化应用。

在这篇文章中，山中伸弥教授重点介绍了塑造我们对 iPSC 重编程理解和医学应用的里程碑式发现，并讨论了二十年以来不断涌现的广泛的当前和未来应用。

重编程机制、iPSC 及相关技术的医学应用的标志性论文

重访重编程效率：对“精英”与“随机”辩论的细致解析

重编程最初令人震惊，不仅因为它可能实现，还因为它效率低下。早期报告指出，只有极少部分的细胞成功重新激活了多能性程序。这种低效引发了一场关于“精英模型”和“随机模型”支持者之间的热烈辩论。

精英模型假设，在一个异质性群体中，只有稀有细胞——可能是祖细胞或类干细胞——保留了固有的可塑性，使其能够对 OSKM 做出反应。这些细胞被认为拥有更易接近的染色质环境或更有利的增殖能力。

随机模型提出了一个更激进的想法：所有体细胞都具有重编程的能力，但该过程需要一系列罕见的分子事件，而这些事件发生的概率很低。从这个角度来看，低效率反映了任务的复杂性，而不是起始群体的局限性。

随着该领域数据的积累，情况变得清晰——两种模型都捕捉到了部分真相。次级 iPSC 诱导系统的发展极大地促进了数据积累。重编程的早期阶段是高度异质性的。单细胞转录组学分析显示，细胞会经历不稳定的中间状态，其特征是体细胞身份的局部丢失和早期多能性相关基因的零星激活。只有其中一些细胞进展到足以激活核心多能性网络，而其他细胞则转向死胡同或恢复为体细胞表达模式。

然而，该领域也了解到，体细胞的初始状态至关重要。角质形成细胞的重编程效率远高于成纤维细胞，因为它们的染色质环境天生就更容易接近。血液祖细胞比重编程末期的淋巴细胞更容易。衰老、氧化应激、线粒体功能障碍和代谢灵活性改变都会影响重编程的易感性。因此，虽然随机性主导早期事件，但体细胞状态与多能性之间的表观遗传“距离”决定了细胞穿越重编程“景观”的可能性。

这种细致的理解强调了内在细胞特性与概率性转变之间的相互作用。重编程既非完全确定性，也非完全随机——它是一个受起始状态和重塑身份的分子事件序列共同影响的混合过程。

细胞重编程的机制：解码可塑性的逻辑

重编程是一个戏剧性的生物学事件。它不仅需要抑制体细胞身份，还需要重建一个类似于早期胚胎的多能状态。这种转变通过转录重组、表观遗传重塑、代谢重连和细胞结构变化的交织波次展开。

OSKM 诱导后的最初几天内会发生第一个可观察到的转变。体细胞转录因子开始失去主导地位，其增强子逐渐关闭。同时，细胞经历间质-上皮转化（MET），这一事件令该领域感到惊讶，因为它揭示了细胞粘附和极性信号对于实现向多能性转变至关重要。MET 反映了细胞远离成纤维细胞身份、转向更类似上皮、胚胎样状态的过程。角质形成细胞的重编程效率高于成纤维细胞，因为它们本质上是上皮性的，绕过了对 MET 的需求。

这种转变通常伴随着代谢变化。严重依赖氧化磷酸化的体细胞减少了线粒体活性，并开始倾向于糖酵解，这是多能干细胞的一个标志。线粒体自身也经历形态重构，变得更小、更不细长——这是代谢转变的视觉表现。

重编程需要染色质的广泛重构。多能性基因通常被锁定在带有 H3K9me3 或 DNA 甲基化的抑制性染色质中。OSKM 的表达启动了染色质开放的缓慢、复杂过程。TET 酶催化多能性增强子的去甲基化，组蛋白修饰复合物去除抑制性标记。染色质重塑因子例如 BRG1 有助于重新定位核小体，为多能性基因激活创造有利环境。

体细胞增强子的去除和多能性增强子的逐渐出现，凸显了染色质结构与转录之间的动态相互作用。增强子-启动子距离发生变化，环状相互作用重新排列，先前沉默的基因组区域为激活做好准备。

核心多能性调控因子的激活代表了重编程的一个临界点。Nanog、Oct4、Sox2 和 Esrrb 形成相互连接的反馈回路，稳定了多能性身份。一旦这个网络建立，细胞就从一种不稳定的中间状态过渡到一个更具决定性的阶段，此时结果变得可预测。

在此阶段，细胞周期加速，G1 检查点缩短，DNA 修复通路进行调整以支持多能细胞特有的增殖增加。染色质整体上变得更易接近，反映了一个为快速分化成多种谱系做好准备的多能性基因组。

随着多组学技术的成熟，人们明显看到仅靠转录因子并不能控制重编程。小 RNA 在从体细胞向多能身份转变过程中微调基因表达。RNA 结合蛋白影响对身份转换至关重要的剪接模式，而长链非编码 RNA 调控增强子活性并稳定中间状态。这些调节因子共同帮助编排定义重编程的复杂分子事件之舞。

随着单细胞转录组学、染色质可及性测序、甲基化谱分析、蛋白质组学和代谢组学的整合，该领域现在接近对重编程轨迹的全面理解。最佳输运模型等计算框架允许研究人员重建数千个单个细胞的轨迹，揭示替代路径、绕行和瓶颈。

重编程不再被视为一条简单的通路，而是被视为一个由转录、染色质、代谢和细胞生理学相互作用塑造的多维“景观”。

iPSC 的医学应用：从早期质疑到成熟的转化渠道

从一开始，iPSC 在再生医学领域就拥有巨大潜力。然而，从概念到临床的旅程远非一帆风顺。早年充满了对安全性、可重复性、基因组完整性和分化潜能的合理担忧。随着时间的推移，谨慎的实验和方法论的改进将这些挑战转化为创新的机会。

早期的 iPSC 生成依赖于有插入突变风险的整合型病毒载体。这些方法虽然有效，但引发了临床应用方面的担忧。非整合系统的开发——附加型质粒、腺病毒、仙台病毒、piggyBac、合成 mRNA，以及最终基于小分子的方法——代表了一个转折点。这些平台不仅消除了基因组整合的风险，还简化了下游的质量控制并提高了可扩展性。

初步研究报告了 iPSC 中令人担忧的拷贝数变异和突变水平。然而，更深入的分析揭示，大多数是预先存在的体细胞嵌合突变，而非重编程的假象。尽管如此，这些发现促使广泛采用严格的基因组质量控制流程。深度测序、甲基化谱分析、核型分析和线粒体基因组分析现在构成了 iPSC 表征的标准组成部分。

残留表观遗传记忆——供体细胞特异性甲基化模式的持续存在——也通过偏向分化潜力构成了挑战。重编程动力学、传代方案和因子表达的改进已在很大程度上解决了这些问题，产生的 iPSC 在分子和功能特性上与胚胎干细胞高度相似。

基因匹配比较表明，人类胚胎干细胞和 iPSC 在分子和功能上基本等同，遗传背景是表观差异的主要混杂因素。尽管如此，细胞系间的变异和不完全的重编程事件——特别是在印记、X 染色体状态和高阶基因组程序等特定表观遗传特征方面——可以以情境依赖的方式影响表型。

从 iPSC 和胚胎干细胞获得成熟细胞类型是该领域早期的瓶颈之一。初始的分化方案产生了类似于胎儿而非成体组织的细胞。随着时间的推移，发育生物学的进步使得能够创建逐步的方案，以越来越精确地重述胚胎信号通路。类器官技术通过提供模拟体内微环境的 3D 环境，进一步改善了分化结果。

如今，iPSC 来源的心肌细胞表现出更成熟的表型，可以从人类 iPSC 来源的类器官芽中生成血管化和功能性的肝组织，并且 iPSC 来源的神经元形成功能性突触网络。虽然完美的成体样成熟仍然是一个前沿领域，但该领域已经从原理证明演示发展到高度复杂的细胞模型。

一个成熟领域的标志之一是全球标准的发展。iPSC 领域很早就接受了这一必要性，采用了多能性评分卡、标准化报告框架和符合良好生产规范的工作流程。国际联盟现在协调最佳实践，以确保全球分发的 iPSC 细胞系符合一致的基准，例如国际干细胞库倡议和人类多能干细胞注册中心。

基于 iPSC 的再生疗法：从概念承诺到临床现实

临床前研究证实，iPSC 来源的细胞可以在宿主组织内存活、整合并发挥功能。在帕金森病模型中，移植的多巴胺能神经元恢复了多巴胺的产生并改善了运动功能。在心脏损伤模型中，iPSC 来源的心肌细胞与宿主心肌同步。来自 iPSC 的视网膜色素上皮细胞表现出结构性整合和对光感受器的支持。

这些成功为推进到首次人体试验提供了必要的依据。早期的基于 iPSC 的试验，一个用于年龄相关性黄斑变性，另一个用于帕金森病，不仅证明了可行性，也证明了自体 iPSC 来源移植物安全性。这些试验突显了细致制造、长期监测和基因组筛查的重要性——所有这些要素后来都被纳入了全球临床实践。

在这些早期试验之后，临床项目迅速扩展。已使用 iPSC 和胚胎干细胞进行了超过一百项临床试验。其中一些已发表的有希望的结果。角膜上皮细胞为治疗失明带来了新希望。多巴胺能祖细胞已进入帕金森病的临床试验，其中 iPSC 和胚胎干细胞来源的细胞迄今显示出相当的安全性和鼓舞人心的疗效信号。需要在更大的患者队列中进行更长期的随访，以确定持久性、疗效和广泛的临床可行性。

虽然自体疗法在概念上很吸引人，但其生产缓慢且昂贵。人类白细胞抗原纯合 iPSC 库的创建——匹配国家大部分人口的供体细胞系集合——为可扩展的同种异体疗法打开了大门。这些细胞可以预先制备、经过质量测试并储存以供立即临床使用。同时，免疫工程已经产生了具有降低免疫原性的“通用” iPSC 细胞系，为真正“现货型”的再生产品提供了可能性。

iPSC 疗法的临床兴起带来了伦理挑战，这些挑战与器官移植和基因治疗中看到的类似，但有其独特细微差别。由于 iPSC 可以从任何个体产生，同意、隐私和数据治理的问题变得尤为重要。随着再生技术变得更加强大和广泛应用，公众参与对于保持信任仍然至关重要。

疾病建模和药物发现：培养皿中的人类生物学

如果再生疗法代表了 iPSC 科学的一个支柱，那么疾病建模则代表了另一个——可以说是当前影响最广泛的一个。

患者特异性 iPSC 模型使得能够研究那些因难以获取原代人体组织而以前无法触及的疾病。肌萎缩侧索硬化症、脊髓性肌萎缩症和帕金森病模型表现出标志性的神经元变性。长 QT 综合征心肌细胞显示出与心律失常风险相关的电生理特征。这些早期成功证明，iPSC 来源的细胞可以重述有意义的疾病表型。早期临床试验的结果支持基于 iPSC 的方法在药物发现，特别是药物再利用方面的潜力。

该领域迅速超越了单基因疾病。精神分裂症、双相情感障碍和自闭症等精神疾病已使用 iPSC 来源的神经培养物和类器官进行建模，揭示了突触形成、网络活动和发育轨迹方面的细微差异。复杂的心脏疾病、代谢紊乱和免疫功能障碍都已使用类似方法进行了探索。

类器官为疾病建模引入了新的维度。继笹井芳树在视网膜类器官的开创性工作（2011 年发表于Nature期刊）之后，其他团队开发了重现皮质分层和神经元迁移方面的大脑类器官，以及为研究囊性疾病、感染和上皮功能障碍提供平台的肾脏和肠道类器官。将类器官融合成“组装体”使得能够研究长程相互作用，例如中间神经元从前脑腹侧迁移到皮质。

iPSC 与 CRISPR 基因组编辑的整合彻底改变了因果推理。通过比较仅在一个致病性变异上不同的同基因对，研究人员可以在没有混杂背景变异的情况下，识别基因损伤的直接后果。这一策略已经阐明了包括心肌病、自闭症谱系障碍和代谢疾病在内的多种疾病的机制。

iPSC 来源的组织现在作为药物发现和安全性测试的平台。心肌细胞可以预测致心律失常潜力，肝细胞评估代谢和毒性反应，神经培养物提供神经毒性信息。在新发传染病暴发期间，iPSC 来源的组织为病毒嗜性和宿主反应提供了窗口。

包含不同祖先来源供体的大型 iPSC 生物样本库对于捕捉人类遗传变异的全谱至关重要。现有的储存库显示出强烈的欧洲血统偏向，突显了需要更广泛的代表性以支持公平的发现。使用大型 iPSC 队列的研究表明，遗传变异塑造细胞表型，包括基因调控和应激反应。由于遗传背景影响治疗反应，多样化的 iPSC 生物样本库为推进个性化医疗和人类功能基因组学提供了必要的基础设施。

iPSC 及相关技术的多样化应用

iPSC 科学的扩展视野

虽然 iPSC 常与治疗和建模相关，但它已经影响了一系列令人惊讶的科学领域。

来自濒危物种的 iPSC 为保存遗传多样性和研究在无法进行实验的有机体中的发育轨迹提供了工具。使用灵长类动物 iPSC 的比较研究揭示了早期神经发育、突触成熟和免疫反应方面的物种特异性差异。

类原肠胚（Gastruloid）和类囊胚（Blastoid）重建了否则在人类中无法获得的早期发育事件。这些模型阐明了原肠胚形成、轴特化和胚层形成的机制。体外配子发生将iPSC应用扩展到生殖生物学，允许研究生育通路和未来潜在的不孕症治疗方法。

最近，将 iPSC 来源的神经元网络与电子系统耦合的工作，产生了能够学习模式、响应刺激和适应行为的混合结构。这些系统挑战了生物智能与人工智能之间的传统区别，引发了关于计算、认知和工程生命系统伦理界限的深刻问题。

也可以公平地说，向多能性重编程的发现有助于促进直接谱系重编程的发展。证明确定的转录因子可以超越稳定的体细胞身份，从根本上改变了该领域看待细胞命运的方式，为将一种分化状态直接转换为另一种状态的想法打开了大门。随后在诱导神经元、心肌细胞和其他谱系方面的工作建立在 iPSC 研究期间确立的概念和技术基础之上，即使这些方法遵循不同的机制路径。

也许最引人深思的前沿领域之一是“返老还童”生物学，部分重编程——短暂暴露于 OSKM 或修饰的因子变体——提供了一种重置表观遗传年龄而不完全抹去细胞身份的方法。动物模型中的早期研究表明，这种方法可以恢复代谢弹性、逆转衰老的分子标记并改善组织功能。如果这些发现能安全地转化到人类细胞和组织，部分重编程可能有助于解决与年龄相关的疾病，不是通过治疗症状，而是通过恢复年轻的细胞状态。这对公共卫生、长寿和慢性病管理的影响是深远的，并且需要我们仔细考虑其治疗前景和潜在风险，例如致瘤性。

iPSC 技术另一个引人深思的扩展是跨物种器官发生，其目标是通过囊胚互补在大型动物宿主（例如猪）中生成人类器官。在初始多能状态方面的进展可能使人类 iPSC 在猪和羊胚胎中发挥贡献作用。尽管主要的生物学和伦理挑战仍然存在，但基因组工程和发育控制方面的持续进展，使得这种方法作为解决器官短缺问题的潜在策略，仍保持着人们的兴趣。

展望：未来二十年

随着 iPSC 领域进入其第三个十年，干细胞生物学、计算、合成生物学和转化医学之间的界限正在消融。下一个时代将不仅仅定义为对重编程或分化方案的渐进式改进，而是由传统上独立发展的学科的更深层次整合来定义。在这种融合的核心，存在着一个简单而深刻的问题：如果我们能控制细胞身份，我们是否也能预测、设计甚至优化它？

即将到来的最具变革性的发展之一是将人工智能整合到干细胞生物学中。多组学数据集现在以前所未有的分辨率捕捉细胞的转录、表观遗传、代谢和结构状态。这些数据集对仅凭直觉而言过于复杂，但在其上训练的人工智能驱动模型已经开始揭示命运决定中的隐藏模式。这些系统可能很快就能预测哪些细胞最容易被重编程，识别成功转变的最早分子特征，甚至提出绕过经典转录因子组合的合成路径。研究人员可能有一天会在计算机中模拟重编程“景观”，在体外验证最有希望的候选方案之前，测试数千个假设的因子组合。

合成生物学也准备同样戏剧性地重塑该领域。可编程转录因子、基于 CRISPR 的表观遗传修饰剂和合成基因回路的进步，允许越来越精确地操纵细胞身份。不难想象，多能性程序可以用小分子开启和关闭，或者分化方案由感知并实时纠正偏差的工程反馈回路引导。安全回路可以防止不受控制的生长，而合成增强子可以稳定在历史上难以分化的组织中的谱系定向。这些创新预示着一个未来，其中干细胞的行为不仅仅是观察或被推动，而是被设计。

生物制造——常常被低估的转化细胞疗法支柱——也将经历深刻变化。封闭系统、自动化培养平台将减少变异、提高可扩展性并增强安全性。这些系统将允许持续监测多能性标记、代谢状态和基因组完整性，将细胞生产从一种手工过程转变为工业化过程。经过工程改造以逃避免疫排斥的通用供体细胞，可能会极大地扩展获得再生疗法的机会，将临床实践从定制治疗转向易于部署的现成解决方案。或者，封闭和自动化系统可能使以合理的成本和时间，为每个患者生成自体 iPSC 成为可能。根据要移植的细胞类型以及患者的免疫和系统状况，可能需要自体 iPSC。

这些科学进步带有伦理、社会和哲学内涵。随着 iPSC 衍生系统开始涉及早期人类发育、生殖、认知和环境管理的方面，社会将被迫面对超出常规生物伦理学范畴的问题。

合成的胚胎样模型挑战我们对发育界限的定义。体外配子发生引发了关于亲子关系、继承和生殖自主权的问题。将神经元与计算硬件耦合的生物混合系统可能引发关于意识、学习和工程化生物网络的道德地位的新辩论。甚至保护生物学——iPSC 可以帮助灭绝物种复活或拯救濒危物种——也提出了关于生态责任和人类干预的长期后果的问题。

应对这些问题不仅需要科学专业知识，还需要持续的公众对话、透明的监管框架以及对全球公平的承诺。获取先进的再生疗法必须在不同人口统计学和地理区域之间是公平的，不依赖于支付能力或与先进医疗中心的接近程度。同样，国际标准将有必要管理 iPSC 衍生材料的创建、共享和治疗使用。

在许多方面，iPSC 的故事是现代科学的缩影：证明了好奇心驱动的研究、跨学科合作以及挑战根深蒂固假设的意愿的力量。始于单个实验室的意外观察，已经重塑了生物学和医学的轮廓。如果说过去二十年揭示了细胞命运之间的障碍比曾经想象的更具渗透性，那么未来二十年将展示生物学、技术和社会之间的界限同样具有流动性。未来的挑战是以想象力、谨慎和对我们正在创造的世界的共同责任感来利用这种新兴潜力。

机器人技术、人工智能和机器学习的进步，将日益自动化实验并加速数据分析，从根本上改变科学家的日常工作流程。然而，变革性的发现将继续依赖于人类的好奇心、直觉和对非传统思想的追求意愿，而技术将作为创造性实验思维的有力放大器，而非替代品。

论文链接：

1. https://www.cell.com/fulltext/S0092-8674(06)00976-7

2. https://www.cell.com/cell-stem-cell/fulltext/S1934-5909(26)00073-1