一作解读 | Engineering | 江苏里下河地...

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（来源：小麦研究联盟）

近日，江苏里下河地区农业科学研究所小麦育种团队联合江苏大学、湘湖实验室、南京农业大学及河南农业大学在《Engineering》期刊在线发表了题为“MutExomeSeq Accelerates the Cloning of PmNCA6 Conferring Powdery Mildew Resistance from Triticum boeoticum”的研究论文。这项研究利用突变体外显子捕获测序技术在育成品系扬YF267中克隆了来源于野生一粒小麦渐渗的抗白粉病基因PmNCA6，该基因编码NLR蛋白，与小麦抗秆锈病基因Sr22为直系同源基因，但功能发生分化，其LRR结构域决定了对白粉菌的专化识别。PmNCA6基因对来自不同麦区的22个白粉菌菌株均表现高抗，且对主要农艺性状及产量无不良影响，在国内推广品种中没有分布，具有重大育种潜力。

一、研究背景

小麦白粉病是由禾本科布氏白粉菌小麦专化型（Blumeria graminis f. sp. tritici, Bgt）引起的一种真菌性病害，是我国小麦生产上主要病害之一。受气候条件影响，长江中下游麦区是白粉病重发区。随着Pm2a和Pm4a抗性逐步丧失，Pm21跃升为该麦区最主要基因源。统计2019-2023年间参加国家和江苏省小麦品种区域试验的414份材料，40%以上的参试品系携带Pm21，而抗白粉病品系中Pm21占比高达95.9%，抗源单一化给本麦区抗白粉病育种带来新的挑战。因此，发掘新的抗白粉病基因资源，创制农艺性状优良的育种亲本用于品种选育，是实现抗病基因合理布局以及延长抗病基因有效周期的重要途径。

二、研究内容

1、PmNCA6的遗传定位

扬YF267是利用携PmNCA6的野生一粒小麦渐渗系NC96BGTA6转育而成的抗白粉病新品系。为了定位PmNCA6，利用扬YF267与感病品系扬09DPBZ杂交构建遗传分离群体，进行极端混池外显子捕获测序分析，将PmNCA6定位于7A染色体的583-699 Mb物理区间（图1，a-b）。利用跨度150 Mb区间的侧翼标记7AK-560和7AID-713对1500个F2单株进行基因型分析，共筛选到25个重组单株，占比仅为1.7%，说明此区间为重组抑制区域。进而对25个重组单株进行抗性鉴定及分子标记检测，将PmNCA6定位到17 Mb物理区间（图1，c）。

图1、PmNCA6基因定位

2、PmNCA6候选基因的克隆

由于抗病区间的重组抑制限制了图位克隆的应用，转而利用突变体外显子测序（MutExomeSeq）策略进行候选基因克隆。利用EMS诱变扬YF267创制了6个独立的感白粉病突变体（图2，a），通过对突变体及野生型进行外显子捕获测序分析，鉴定到一个编码CC-NBS-LRR的基因NLR1（TraesCS7A03G1212700）在所有突变体中均发生非同义突变（图2，b-c）。因此，将NLR1作为PmNCA6的候选基因进行功能验证。从白粉菌诱导的扬YF267 cDNA中克隆NLR1，共获得3种转录本：NLR1_V1，NLR1_V2和NLR1_V3。荧光定量分析结果表明，白粉菌诱导后3个转录本的表达量均无显著差异。

图2、PmNCA6候选基因克隆

3、NLR1功能验证

通过分析NLR1基因序列，在其NBS和LRR结构域各选择长度为150 bp序列为沉默靶点，进行病毒诱导的基因沉默（VIGS）分析。结果显示，沉默NLR1后，扬YF267叶片均出现白粉菌孢子堆（图3，a-b），表明NLR1在介导扬YF267抗白粉病反应中发挥了关键作用。将3个NLR1转录本分别插入转基因载体pLG-OE3，构建过表达载体Ubi:NLR1_V1、Ubi:NLR1_V2和Ubi:NLR1_V3。将包含NLR1及其启动子和终止子片段插入去除Ubiquitin启动子的pLG-OE3，获得NLR1自身启动子驱动的表达载体PNLR1:NLR1。利用农杆菌介导法将上述4个表达载体转化感病小麦品种Fielder。在PNLR1:NLR1、Ubi:NLR1_V1和Ubi:NLR1_V2转基因事件中，标记检测为阳性的单株对白粉病均表现高抗，标记检测为阴性的单株均感病（图3，c-e）；在Ubi:NLR1_V3转基因事件中，标记检测阳性和阴性单株均感病（图3，f）。VIGS和转基因功能验证结果表明，NLR1就是PmNCA6，它可通过NLR1_V1和NLR1_V2两个转录本介导扬YF267对白粉病的抗性。

图3、候选基因NLR1抗病功能验证

4、PmNCA6抗病功能结构域分析

通过数据库检索发现，PmNCA6与来源于栽培一粒小麦的抗秆锈病基因Sr22a为直系同源基因，二者基因编码区的序列一致性为97%，蛋白序列一致性为95%，差异位点大多集中在LRR结构域（图4，a）。为了研究PmNCA6和Sr22a在白粉病抗性功能上的差异，人工合成两个融合基因NCG1和NCG2并转化Fielder，其中，NCG1携带Sr22a的CC-NBS结构域和PmNCA6的LRR结构域，NCG2携带PmNCA6的CC-NBS结构域和Sr22a的LRR结构域（图4，b）。同时，构建了Sr22a过表达转基因株系作为对照。对T1代NCG1、NCG2和Sr22a转基因单株进行标记检测和抗病性鉴定，结果显示NCG1转基因阳性株系高抗白粉病（图4，c），而NCG2和Sr22a转基因阳性株系对白粉菌均表现感病，表明PmNCA6的LRR结构域在其介导抗白粉病反应中至关重要。

图4、PmNCA6抗病功能结构域分析

5、PmNCA6的进化分析

利用麦类作物基因组数据库进行序列比对，PmNCA6仅与野生一粒小麦TA299中注释的基因Tm.TA299.r1.7AG0168310完全一致。进一步从TA299参考基因组提取所有NLR基因蛋白序列，构建包含PmNCA6、Sr22a、TraesCS7A03G1212700及野生一粒小麦NLRs的系统发育树，PmNCA6、Sr22a和TraesCS7A03G1212700形成独立分支，表明它们是直系同源关系。对扬YF267外显子捕获测序数据与中国春和野生一粒小麦TA299参考基因组进行比对分析，结果显示扬YF267的7A染色体623–703 Mb区域存在约80 Mb的野生一粒小麦渗入片段。对不同国家和地区收集的24份野生一粒小麦进行白粉病抗性鉴定和PmNCA6单倍型分析，共检测到10种单倍型（PmNCA6a-PmNCA6j），其中，6份抗病材料中携带PmNCA6/PmNCA6a，5份抗病材料中携带PmNCA6b，1份抗病材料中携带PmNCA6c，PmNCA6d-PmNCA6j为感病单倍型。

6、PmNCA6育种利用价值评估

在扬YF267/扬09DPBZ构建的RIL群体中随机选取50个抗病家系作为抗病组，50个感病家系作为感病组，进行主要农艺性状比较。抗病组与感病组在株高、穗长和穗粒数方面没有显著差异，仅抗病组的每穗小穗数低于感病组。通过创制了扬09DPBZ背景的PmNCA6近等基因系扬24M105进行连续2年的产量鉴定，PmNCA6对产量无显著不良影响。利用PmNCA6功能标记对435份黄淮麦区审定品种和118份长江中下游麦区审定品种进行分析，均未检测该基因。为分析PmNCA6对白粉菌不同生理小种抗性，利用22个白粉菌菌株进行抗性鉴定，PmNCA6转基因材料对所有生理小种均表现高抗。综上，PmNCA6具有广谱的白粉病抗性，对主要农艺性状和产量无显著不良影响，是具有突出育种价值的优异后备抗源。

江苏里下河地区农业科学研究所小麦育种团队万文涛助理研究员和赵仁慧副研究员为论文的共同第一作者，别同德研究员、江苏大学何华纲副教授及湘湖实验室李洪杰研究员为论文的共同通讯作者。这项工作获生物育种钟山实验室（ZSBBL-KY2023-02-2）、国家自然科学基金（32201808，32472102）及江苏省自然科学基金（BK20231321）等项目资助。

小麦族多组学网站：http://wheatomics.sdau.edu.cn

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