【前沿&进展】J Virol | 蓝柯教授团队成功揭示卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）RTA调控病毒裂解复制新机制

近日，高致病性病毒与生物安全全国重点实验室/武汉大学生命科学学院/泰康生命医学中心蓝柯研究组在国际学术期刊Journal of Virology发表了题为Repression of EEF1D by KSHV RTA Promotes Viral Lytic Reactivation的研究论文。该研究揭示了卡波氏肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）裂解复制开关分子RTA作为转录抑制因子下调宿主抗病毒蛋白EEF1D从而促进病毒裂解复制的新机制。

卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV），又称人类疱疹病毒 8 型（HHV-8），是导致卡波西肉瘤（KS）、原发性渗出性淋巴瘤（PEL）和多中心卡斯特曼病（MCD）的主要病原体。KSHV 在宿主体内主要以潜伏感染（Latency）状态存在，此时病毒基因组保持静默，仅表达极少数基因以逃避宿主免疫清除。然而，在特定环境刺激下，病毒会进入裂解性激活（Lytic Reactivation）阶段。这一过程对于病毒的水平传播及致病性至关重要，因为大量的病毒颗粒产生会导致细胞裂解和炎症反应。这一转变的“总开关”是病毒编码的复制与转录激活因子（RTA）。虽然 RTA 的促激活作用已被广泛研究，但宿主细胞如何通过限制 RTA 的功能来维持潜伏状态，以及 RTA 如何反过来瓦解这些宿主“防御枷锁”，仍是病毒学领域的核心课题。
本研究聚焦于真核翻译延伸因子EEF1D（eukaryotic translation elongation factor 1δ）。传统上认为 EEF1D 参与蛋白质合成，但其在病毒生活周期调节中的非经典功能此前尚不明确。本文采用了分子生物学、生物化学与遗传学相结合的多维度实验方案，即（1）功能筛选与验证： 利用 CRISPR/Cas9 基因敲除技术和过表达实验，观察 EEF1D 水平变化对 KSHV 裂解基因表达（如 ORF50/RTA, ORF45, K8）及病毒滴度的影响。（2）蛋白质相互作用分析： 通过共免疫沉淀（Co-IP）和免疫荧光共定位实验，检测 RTA 蛋白与 EEF1D 之间的物理结合。（3）转录调控研究：采用双荧光素酶报告基因实验（Luciferase Assay）和定量 PCR（RT-qPCR），评估 RTA 是否在转录水平上抑制 EEF1D基因的启动子活性。（4）蛋白质稳定性实验：使用蛋白质合成抑制剂（放线菌酮，CHX）处理细胞，观察 RTA 存在下 EEF1D 蛋白的降解动力学，并利用蛋白酶体抑制剂（MG132）探究其降解途径。（5）进化保守性分析： 对其他灵长类（如恒河猴 rKSHV）及啮齿类（如 MHV-68）的 γ-疱疹病毒同源蛋白进行对比实验，分析该机制的进化演变。
实验结果显示，敲除 iSLK-RGB 等细胞系中的 EEF1D 会显著增强 KSHV 的裂解性基因表达，并增加子代病毒的产生。相反，过表达 EEF1D 则能有效抑制 RTA 诱导的病毒激活。这表明 EEF1D 在生理条件下起到了“分子刹车”的作用，维持病毒的潜伏状态。
研究发现，KSHV 的 RTA 蛋白演化出了一种极为高效的策略，从两个层面清除 EEF1D 的阻碍，即RTA 对 EEF1D 的双重打击机制：

• 转录抑制：RTA 能够结合在 EEF1D 基因的启动子区域，通过抑制其转录活性，从源头上减少 EEF1D mRNA 的产量。

• 翻译后降解：RTA 充当了 E3 泛素连接酶或其招募者，与 EEF1D 直接结合并诱导其通过泛素-蛋白酶体途径发生降解。这是首次证明 RTA 具有靶向降解该类延伸因子的能力。

通过截短体突变实验，研究确定了 RTA 的 C 端转录激活域对其抑制 EEF1D 至关重要。同时，RTA 的特定基序负责与 EEF1D 结合，这一发现为未来筛选阻断该相互作用的小分子药物提供了靶点。研究进一步发现，这种“RTA-EEF1D 拮抗轴”在人类 KSHV 和恒河猴 rKSHV 中高度保守，但在鼠类 γ-疱疹病毒 MHV-68 中并不存在。这暗示该机制是灵长类疱疹病毒在长期进化中为了适应宿主环境而获得的特有策略。

RTA抑制EEF1D以促进KSHV裂解复制的机制示意图

由于既往尚没有KSHV RTA作为转录抑制因子的报道，团队深入研究了RTA转录抑制EEF1D的功能机制，发现这一抑制作用是由RTA通过与DNA甲基转移酶DNMT3A相互作用，并与另一转录因子PATZ1形成复合物，最终由PATZ1将该复合物招募至EEF1D的启动子区域从而引起EEF1D启动子超甲基化和转录抑制。有趣的是，KSHV RTA作为转录抑制因子抑制EEF1D转录的现象在灵长类γ疱疹病毒中具有保守性。

总之，该研究首次揭示了KSHV RTA可作为转录抑制因子下调宿主抗病毒蛋白从而促进病毒裂解复制，拓展了对RTA功能的认识，并为理解KSHV再激活裂解复制机制提供了新的见解。

武汉大学生命科学学院博士研究生向敏为该论文的第一作者，蓝柯教授为通讯作者。该研究得到了国家自然科学基金、国家重点研发计划等项目的资助。