无扫描双光子电压成像

图1：使用电压敏感染料与计算机生成全息技术成像神经活动的流程。

背景

智能成像创新公司(3i)研究小组的主要兴趣之一是开发和改进不同的成像技术。全息显微镜硬件的近期工程和概念改进为该技术开辟了新的应用领域，其中一个由全息显微镜实现的功能是，可以使用纯相位激光调制将光定位在样品的空间受限部分。

传统的双光子成像方法通常依赖于样品内的点扫描。虽然该方法已确立，但扫描过程耗时，且由于成像速度本质上受限于镜速(对于128x128像素阵列，共振扫描仪的速度低于100赫兹)，难以捕捉快速的神经动力学。无扫描双光子激发方法解决了这一不足，其中全息技术可以定位样品中的特定区域，并通过消除机械扫描引入的延迟来提高双光子成像的时间分辨率。当与适当的硬件和正确的样品制备策略结合使用时，无扫描双光子光刺激是收集电生理数据的门户。

膜片钳电生理学是记录神经活动的黄金标准，但该技术无法同时记录多个细胞的电活动，通常仅限于两个细胞。其侵入性特性使得在体内进行具有挑战性，并且需要高度熟练的人员。与电生理学不同，3i提出的这种方法侵入性极低，能够同时记录多个神经元细胞和亚细胞结构。通过设计成像方法以匹配基因编码电压指示剂(GEVIs)的光物理特性，可以实现双电位成像[1]。这一强大的工具克服了传统方法的缺点，可用于众多应用，例如高保真记录高频尖峰序列和去极化、在小鼠大脑中深达250微米的体内成像、使用单一激光源同时触发和成像动作电位等等。

这种创新方法的总体目标是进行更详细的神经活动研究，潜在地促进对神经系统疾病更好的理解。

图2：上图：表达Jedi-2p-Kv的旁巨细胞网状核急性切片(样品由巴黎ENS的Rémi Fournel和Gilles Fortin提供);下图：无扫描双光子电压成像实验(2P电压成像由巴黎视觉研究所的R. Sims、Dimitri Tanese、Soledad Dominguez、Imane Bendifallah和Valentina Emiliani合作完成)。

挑战

要记录具有短采集时间和高信噪比(SNR)的双光子电压图像，对探测器有相当高的要求。为了匹配实验所需的时域灵敏度，一个能够以kHz范围采集频率收集数据的探测器至关重要。这需要毫秒级的曝光时间，从而限制了信号水平。为了以高速成像，理想的探测器需要具有高灵敏度，以便在短暂的曝光窗口内捕获足够的信号。此外，电压成像不仅涉及低信号强度，还涉及信号的微小波动，这意味着灵敏度至关重要，以便捕捉相关的生理数据。

探测器的速度和灵敏度都需要与无扫描双光子电压成像系统的应用相匹配，以实现理想功能并避免任何成像上的妥协。

我们对Kinetix相机的速度感到满意。——Osnath Assayag博士

解决方案

Kinetix22 sCMOS相机是一款多功能且强大的成像解决方案，兼具灵敏度、采集灵活性和时间分辨率，能够实现无扫描双光子电压成像。在8位速度模式下，其帧率可超过660 fps(Hz)，适用于整个2400 x 2400(>5 MP，22毫米对角线)传感器;在16位模式下，其帧率也可达118 fps(Hz)。此外，该相机还支持在芯片上设置感兴趣区域(ROI)，通过减少读出像素数量，大幅提升图像采集速度。在灵敏度模式下对小ROI成像时，其采集频率仍可超过1 kHz。Kinetix22传感器的量子效率在可见光波段超过95%，读出噪声小于1个电子，能够为电压成像提供高质量图像流。这些特性使得Kinetix22成为无扫描双光子电压成像的理想探测器。