Cell | Jason McLellan 团队解析安第斯病毒糖蛋白的原位高分辨率结构

ANDV 是一种人感染致死率高达40%的新世界汉坦病毒（New World Hantavirus es, NWHs），其自然宿主主要为为啮齿类动物。依据其宿主分布地理位置， 汉坦病毒被划分为旧世界汉坦病毒（ Old World Hantavirus es , OHWs ）和新世界汉坦病毒【1】。 OWHs 主要分布于亚洲，欧洲和非洲，其中中国是主要流行地区之一，每年感染人数平均在11000人左右【2】。人体感染 OWHs 后会产生肾出血热综合征（ Hantavirus hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS ），其致死率可达12%。 NHWs 主要分布于南美洲和北美洲，人感染 NHWs 后会产生汉坦病毒综合症（ Hantavirus pulmonary syndrome, HPS ），其感染致致死率可高达60%【1】。人体主要通过吸入雾化的感染的啮齿类动物分泌物而感染，但 ANDV 可以直接通过亲密接触进行人际传播【3,4】。目前，尽管中国和韩国批准了基于灭活汉坦病毒颗粒疫苗的使，但灭活病毒疫苗通常存在免疫原性较低且诱导长期免疫效应不足以及无法诱导细胞免疫等问题。此外，世界上尚无通过 WHO 或美国 NIH 审核的汉坦病毒疫苗上市。因此， ANDV 对人类健康构成重大挑战。

与其他汉坦病毒类似， ANDV 属于布尼亚病毒纲【5】，是一种分段反义 RNA 包膜病毒。这意味着其基因组是三段分段的反义 RNA, 被包裹在脂双层膜里。依据其基因组大小， ANDV 基因组被命名为large (L), Medium (M), small(S) ，其中M段编码2 种 病毒糖蛋白， Gn 和 Gc 。在宿主细胞中翻译时， Gn 和 Gc 会首先形成异源二聚体，然后异源二聚体聚合形成四聚体，四聚体最终相互作用在囊膜表面形成格栅状结构（lattice）并促进病毒自组装与出芽。在现有的四聚体和格栅模型中， Gn 排列在内侧介导四聚体组装，而 Gc 排列在侧边，介导四聚体间的相互作用【6,7】。在入侵宿主细胞时， Gn 负责和受体结合，介导病毒内吞；当病毒颗粒被内吞进入内体（endosome）后，受内体内逐渐降低的p H 刺激， ANDV 糖蛋白网状结构解体，释放融合蛋白单体 Gc, 其在低p H 条件下会进行不可逆的三聚化，形成融合后蛋白三聚体，并驱动病毒脂双层膜与内体细胞器膜融合，从而将其基因组 RNA 释放到宿主细胞细胞质中，进行复制，转录和翻译，最后组装子代病毒。

尽管汉坦病毒所造成的巨大威胁，但我们依然没有汉坦病毒颗粒的原位高清结构，对 ANDV 的自组装机制以及病毒颗粒如何响应内体低 pH 刺激也知之甚少。这主要受限于汉坦病毒的 BSL3 (Biosafty Level 3) 生物安全操作环境要求。此外，由于汉坦病毒颗粒的多形 (pleomorphic) 特征， 传统的冷冻电镜单颗粒分析技术（ S ingle -particle cryo-EM ）无法应用于具有这一特征的病毒，目前唯一的方案是冷冻电镜电子断层三维重构（cry o-electron tomography, cryo-ET ）和亚断层平均技术（sub tomogram averaging ）。但该方案对软件和硬件有较高要求，且利用该方案获得近原子分辨率尺度的结构具有较大难度。最后，抗体介导的体液免疫在抗汉坦病毒感染过程中发挥了重要作用，但传统的基于 X -射线分析（ X-ray crystallography ）和可溶性蛋白 (soluble protein) 的结构表征策略无法快速地获得抗原表位信息，也无法获得抗体结合对汉坦病毒表面格栅结构的动态影响信息，因此极大地限制了基于结构的疫苗设计策略的应用，阻碍了新型高效疫苗的开发工作。

2026年2月27日，美国德克萨斯大学奥斯汀校区的 Jason McLellan 教授团队 ( 郭鲁强博士独立一作 ) 在 C ell 杂志发表了题为 High-resolution in situ structures of hantavirus glycoprotein tetramers 的研究论文，系统性的解决并回答上述问题。团队首先使用cryo -EM 对基于重组水疱性口炎病毒的假 ANDV 病毒（ recombinant vesicular stomatitis virus-based ANDV pseudo-virus,rVSV-ANDV）进行成像，发现 ANDV 糖蛋白主要分布于子弹状病毒颗粒的两端。而后，团队利用e VLP （ EPM+EABR ）标签 【 8 】 ，为高危病毒建立了一套完整的基于病毒样颗粒（ VLP ）的新型冷冻电镜单颗粒分析体系。利用该体系，研究团队获得了 ANDV 四聚体以及二聚化的四聚体（dimer of tetramers） 的原位高分辨率结构，揭示了 ANDV 病毒颗粒的组装、稳定以及低 pH 响应的分子机制，表征了广谱汉坦病毒抗体 ADI-65534 中和病毒感染的分子机理。最后，团队探索了基于新型自扩增 RNA （ repRNA ）平台 【 9 】 的汉坦病毒疫苗的开发潜力 。

为研究 ANDV 的原位高清结构，同时避开病毒的 BSL3 要求，研究团队首先利用cryo -EM 对r VSV-ANDV 进行成像 , 惊讶地发现 ANDV 糖蛋白主要分布于子弹状的 VSV 病毒颗粒的两端， 与野生型 VSV 糖蛋白的分布形成鲜明对比【10】。研究团队进一步研究了r VSV-SARS-CoV-2 和r VSV-CCHFV 的糖蛋白分布情况 , 发现 SARS-CoV-2 S 糖蛋白相对均匀地分布于子弹状病毒颗粒的表面，而 CCHFV 糖蛋白类似地分布于子弹状病毒颗粒的两端。这一发现与报道的其他的基于 VSV 假病毒糖蛋白均匀分布的观察形成鲜明对比， 对基于 VSV 的布尼亚病毒的疫苗开发以及效用评价具有重要的指导意义。

在cryo -EM 成像过程中，研究团队注意到样品中含有一些表面覆盖高密度 ANDV 糖蛋白的 VLP s (ANDV-VLPs) 。因为其表面网状结构更贴近真实病毒颗粒的状态且ANDV 糖蛋白密度远高于r VSV-ANDV ，因此，研究团队更换研究目标为 ANDV-VLPs 。通过多轮测试，研究团队最终发现，相对于野生型ANDV 构建， 将 eVLP 标签整合至 Gc 胞内段，可以提升 VLPs 产量至30倍左右 。而后 , 为获得近原子分子分辨率尺度的ANDV糖蛋白的原位结构，研究团队经系统性优化传统的单颗粒冷冻电镜分析流程的关键步骤，包括蛋白颗粒挑选方案（particle picking stra tegies ） ， 蛋白颗粒提取大小（extraction box size ）以及中心再聚焦（re centering ）策略 , 最终 建立了一套完整的适用于pl eomorphic 病毒颗粒的原位高分辨结构的电镜数据处理流程 。

基于这一流程，研究团队首先解析了分辨率达2.35 Å 的 ANDV 糖蛋白 Gn-Gc 异源四聚体库伦电势图（co ulomb potential map ），然后建立了除胞内段外的 Gn-Gc 四聚体全原子模型。基于此，团队提出了 ANDV 糖蛋白四聚体的组装机制，即 ANDV 糖蛋白四聚体主要由 Gn1-G c 1, Gn1-Gn2 以及 Gn 2 -Gn 2 三个界面主导，且水分子在稳定四聚体相互作用过程中发挥了重要作用 。为获得格栅结构的组装机制，研究团队聚焦于dimer of tetramers, 重新提取蛋白颗粒。通过类似的数据处理流程，获 得 dimer of tramers 三种密切相关的构象，即构象 I, II, II 。三种构象的分辨率分别为3.2 Å ，3.4 Å ， 3.4 Å 。这三种构象代表了四聚体相对于二聚化界面在脂双层中不同的弯曲状态 。通过仔细分析三种构象 , 团队发现d imer of tetramers 主要由 Gc 的二聚化介导四聚体的聚合 , 与之前的报道一致 【 11 】 。但细究其 Gc 相互作用机制 , 团队发现 Gc 二聚体原位结构缺少之前晶体结构中观察到的多个二聚体间氢键，因此该弱相互作用界面奠定了三个弯曲构象的出现并解释了 ANDV 病毒颗粒的 pleomorphic 的分子机理。同时 , 团队意识到，在 dimer of tetramers 中，四聚体相对彼此是倾斜的 , 因此 , 如果这种状态代表了一种能量最低的状态的话， 那么就为 ANDV 糖蛋白自组装病毒颗粒提供了合理解释。

此外，团队还发现 , 在几乎所有参与形成 ANDV 糖蛋白四聚体以及dimer of tetramers 的关键界面中均有一个或多个组氨酸，并临近带正电的氨基酸聚集区或者与其他组氨酸相互作用 。因此，当p H 降低时 , 组氨酸质子化 , 会与正电的氨基酸相互排斥 , 由此扰乱关键相互作用界面 , 驱动格栅解体 , 四聚体分离 , 从而释放融合蛋白 Gc 单体 , 为其不可逆的三聚化创造条件。因而原位结构模型为 ANDV 糖蛋白低 pH 响应提供了合理的分子机制。

为验证建立的电镜数据体系的可用于抗原表位的表征，研究团队选择经过亲和力成熟优化的广谱汉坦病毒抗体 ADI-65534 。通过共孵育抗体结合片段 (Fragment a ntigen binding, Fab) 与 ANDV-VLPs 以及类似的数据处理流程，团队获得了3.3 Å 的 ANDV-VLPs-65534 Fab 的原位四聚体结构以及6 . 8 Å 的 dimer of tetramer s结构。 ANDV-VLPs-65534 Fab 的原位四聚体结构解释了ADI-65534相对其前代抗体高亲和力的分子机制【12】, 而当尝试匹配 ANDV-VLPs-65534 Fab 的原位四聚体结构至d imer of tetramer s 库伦电势图中时，则显示 65534- Ab 只能结合弯曲度最大的构象 III ，因而揭示了抗体结合对格栅结构的动态影响。此外，当等距放置Fc并测量抗体结晶片段（ Fc ）与 Fab 末端氨基酸残基的距离时，团队发现 全长 IgG 1难以交联邻近四聚体 ，因此推翻了之前发表的65534- IgG1 交联邻近四聚体的假设。

最后，为探索 ANDV-VLPs 作为疫苗的潜力，研究团队使用自扩增 RNA (repRNA)【9】作为编码递送平台，通过免疫小鼠来检测体液和细胞免疫响应。研究发现，在10 ug的递送量下，相比野生型 ANDV 构建 ( re pRNA-ANDV-WT) , 带有突变和e VLP 标签的构建（re pRNA-ANDV-DM-eVL P）可以最大化的刺激总IgG抗体响应，但中和抗体诱导量和T细胞免疫水平诱导上则无显著差异 。该现象与观察到的引入eVLP可显著提升VLP表达量以及报道的基于e VLP 和 2 ug传统mR NA 的 SARS-CoV-2 S 糖蛋白可显著提升总抗体量以及中和抗体量【8】的结果相冲突，因此尚需更多研究来解释其差异。

https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(26)00117-0

制版人： 十一

参考文献

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