如何从药理学角度提升药物研发成功率

小分子药物发现筛选技术进展很快，包括细胞检测、计算筛选以及借助结构生物学的生物物理学方法。技术的进步提高了筛选命中率，并使得针对难成药靶点的候选药物筛选成为可能。然而，候选药物在临床试验中的失败率仍非常之高，疗效不足是主要原因之一。候选药物因疗效问题导致高失败率可能有四个原因：1）对治疗疾病所需的药理作用理解不足；2）为实现预期效果选择了不合适的靶点；3）所选候选药物无法有效调节靶点；4）未能充分表征候选药物的全部作用，且未在合适的目标群体中进行评估。

前两个原因源于对疾病病理生理学缺乏全面了解，这仍将是新药发现的挑战，尤其是对于更复杂的疾病。这类疾病中，单一靶点无法被确定为疾病的关键成因，且患者间存在显著异质性。后两个原因则是与候选药物的表征有关，也是本文将讨论的主题。这其中，最受关注的靶点家族是G蛋白偶联受体（GPCRs）。因为近期技术进步（如利用冷冻电子显微镜确定GPCR复合物结构）以及对该家族信号传导细微差别的理解，揭示了调节GPCR以实现治疗获益的新方法。此外，变构调节和偏向信号传导的融入，彻底重振了GPCR研究。当然，部分观点可能适用于其他靶点家族，如激酶、核受体和离子通道。

药物发现研究曾致力于寻找模拟内源性分子（如肽激素或神经递质）激活GPCRs的激动剂，或阻断这些内源性分子与其在GPCR上的结合位点（即正构位点）相互作用的拮抗剂。如今已知，GPCRs通过多种构象状态介导复杂信号以影响生理过程，这些构象状态可激活或阻断涉及多种细胞内转导分子（包括G蛋白、GPCR激酶和β-抑制蛋白）的特定信号通路。不能假设合成配体会产生与天然激素和神经递质相同的效果，也不能假设阻断其作用会完全消除这些信号。

随着技术的进步，细胞功能学检测已能识别和表征新型分子，例如偏向激动剂（选择性稳定特定GPCR构象状态，优先激活特定细胞内信号通路而牺牲其他通路）和变构调节剂（通过结合受体上除正构位点外的位点，影响GPCR与细胞内转导分子的相互作用）。其结果之一是筛选命中率可能提高，因为对于变构配体，蛋白质的整个表面都可被视为潜在的有效结合位点。例如，GPR40上已发现三个分离的拮抗剂变构结合位点。此外，变构调节和偏向信号传导均为开发候选药物提供了机会，这些候选药物的特性可能解决现有药物针对已知靶点的局限性，或作用于此前未被开发的“禁忌”靶点。

为更有效地利用这些机会，本文首先总结苗头化合物和先导化合物体外药理学表征的关键方面，重点举例说明过去和当前药物开发项目中，此类知识已发挥或可能发挥价值的案例。随后讨论转化为体内活性的挑战，以及更复杂的药理学分析在表征候选药物疗效、提高进入临床试验的候选药物成功率方面的潜力。

体外药理学表征

在初步筛选中确定具有合适特性、可进一步开发的苗头化合物后，下一步是将这些化合物优化为先导化合物，并最终转化为候选药物。需要优化的特性众多，其中一些与化合物对目标治疗靶点的作用相关，另一些则涉及对其他蛋白质的影响，而为了降低安全风险，这类影响需尽量避免。还有一些特性对化合物的ADME（吸收、分布、代谢和排泄）特征至关重要。

本文的讨论重点是与化合物对目标靶点作用相关的特性优化。但在实际研究中，多种特性的优化往往同步进行，且为解决某类特性（如安全性）的问题，可能需要在另一类特性（如效价）上做出妥协。

苗头化合物和先导化合物的优化依赖于药理学检测，而检测方法的性质对这一过程至关重要。综合性检测（即能捕捉受体与信号蛋白之间多种相互作用信息的检测）相比仅关注单一相互作用的检测（如放射性配体结合检测或仅测量对环磷酸腺苷等单一第二信使影响的检测），有潜力发现候选分子更多的效应。此外，改变检测所监测的细胞内功能级联反应的节点，也能提高检测的灵敏度（级联反应越下游，检测涵盖的范围越广，如下图所示）。

针对GPCR靶点的化合物，其体外药理学苗头与先导化合物优化通常会研究四个特性：结合模式（正构或变构）、亲和力、效能以及相互作用动力学。化合物的结合模式主要分为正构和变构两种情况，二者最大的区别是前者会排除内源性配体的作用。亲和力反映了与组织中受体结合的强度——具体而言，药物对特定受体的亲和力以Kd⁻¹表示，其中Kd（平衡解离常数）是药物-受体复合物的解离速率（koff）除以结合速率（kon）。

效能

效能则指的是靶点结合后观察到的药理效应是什么。比如PD-L1配体与其受体PD-1结合后，可以抑制T细胞功能。而药物发现的主要目标便是获得具有治疗价值的候选分子。但候选药物的效能本质往往仅从已知靶点特性的有限视角推断。若靶点的信号传导能力具有多效性，实际上许多靶点确实如此，则介导的药理作用全部效应可能尚未被完全了解。

一个分子的治疗价值可能源于其具备的一系列效能，而非单一活性。例如，理论上β受体阻滞对心力衰竭有益，但在16种测试的β受体阻滞剂中，仅有少数（其中卡维地洛效果最佳）显示出真正的治疗效能。这就引出一个问题：若不考虑药代动力学差异，为何并非所有16种分子都对心力衰竭有效？其中一个解释是β阻滞这一单一特性并非关键因素。卡维地洛的一系列效能（阻滞β2肾上腺素受体和α1肾上腺素受体、抗氧化作用、抗内皮素作用以及抗增殖特性）可能是关键，而非单一药物特性。这些数据表明，候选药物在体内传递的信号可能比之前认为的异质性高得多，因此尽可能识别候选分子的多种效能，对于解释复杂体内研究中可能出现的令人困惑的数据非常有用。

然而，识别效能谱并理解其整体影响可能受限于测试时的可用技术。例如，1964年由詹姆斯・布莱克领导的帝国化学工业团队发现的β受体阻滞剂普萘洛尔，可能是有史以来临床测试最多的药物。但在普萘洛尔被发现为β受体阻滞剂41年后，人们才发现它是ERK激酶激活剂，原因仅是此时相关检测方法才出现。这强调了需要持续研究已知药物，以了解其临床效应是否部分源于此前未表征的活性。由此引申出一个结论：效能与用于测量它的检测方法密切相关。因此，在任何给定检测中未观察到效能，未必表明不存在效能，可能只是使用了不合适的检测方法。

与全面识别所需治疗效能相关的是，早期识别导致副作用的不想要的效能。这类研究应与先导化合物优化研究并行开展，以避免陷入具有潜在缺陷的化学骨架。例如，若测试分子被证明对hERG钾通道有活性，则在通过药物化学手段从先导骨架中去除这一特性之前，继续进行先导化合物优化毫无意义。

特定激动剂对不同信号通路的内在活性（即最大反应）正用于药物开发。例如，TRV130的选择性偏向性信号特征的一个重要部分是β抑制蛋白信号传导（相对于G蛋白信号传导）降低50%，这实质上减弱了该分子的β抑制蛋白反应。事实上，阿片受体的部分激动作用正被用于研究，以实现具有治疗价值的阿片类镇痛效果。这种方法也被用于新型GLP-1受体偏向激动剂（如替尔泊肽）的研究。GLP-1/GIP受体激动剂替尔泊肽在GIP受体上相对于β抑制蛋白2招募和环磷酸腺苷积累，偏向于ERK1/2磷酸化。研究表明，替尔泊肽减少β抑制蛋白招募，从而减少GLP-1受体脱敏和下调。目前，尚无足够数据确定这些激动剂的良好治疗特征是源于多受体激活还是偏向性信号传导，但这些分子确实体现了复杂的多种效能在临床中的影响。

与靶点相互作用的动力学特性

尽管体外实验中会保持药物浓度恒定以进行测量，但体内药物浓度从未恒定，因此药物在体内与靶点结合的持续时间，对候选药物的整体治疗效能和选择性而言可能是非常重要的特征。

体外研究中，探索和优化候选药物与靶点相互作用动力学的常用模型是“药物-靶点驻留时间模型”。该模型的核心特征是：尽管体内药物-靶点复合物的寿命由结合速率（kon）和解离速率（koff）共同决定，但在同一化学系列中，受扩散速率等影响kon的因素限制，实际上koff往往是关键决定因素。这种情况下，药物-靶点驻留时间（定义为1/koff）可通过先导化合物优化阶段的体外实验简单测量，从而助力实现理想的体内药代动力学特征。

事实上，有案例表明治疗效能更多依赖体内药物-靶点复合物的寿命而非效价。例如血管紧张素II亚型1受体拮抗剂，药物是否产生差异性或不可逆转的阻滞作用，与药物和受体的结合持续时间高度相关。

尽管体内药物-靶点复合物的寿命通常与受体区域的药物浓度相关，但当koff极慢时，药效学与药代动力学可能出现背离。此时，靶点区域的药物存在与药物反应会相互分离，药物与受体结合产生的效应持续时间，会超过可观测到的药物清除时间。

体内药代动力学-药效学分离的例子如下图所示。总体而言，与靶点共价结合的不可逆药物具有这一特性，与靶点强结合的药物也可能出现类似情况。例如，儿茶酚-O-甲基转移酶（COMT）抑制剂奥匹卡朋就表现出显著的药代动力学-药效学分离：其血浆终末半衰期仅1.0-1.4小时，但因驻留时间长，奥匹卡朋诱导的COMT抑制半衰期超过100小时。通过不可逆清除靶点，如利用蛋白水解靶向嵌合体（PROTACs）降解靶蛋白，也可实现同样的效果。

不过，kon也并非不重要，kon也可能是影响体内药物-靶点复合物寿命的重要因素。在体内受限的受体结合区域，kon的差异可能极为重要。具体而言，由于kon是二级速率常数，若因扩散受限导致区域内配体浓度升高，配体浓度可增强kon的作用。这可能引发“受体再结合”现象，以koff速率从靶点解离的配体不会通过自由扩散离开区域，而是重新结合并占据受体。这会显著延长体内药物效应，使kon成为候选药物表征的重要参数。

因此，测量kon和koff可共同表征候选分子的预期效应：当kon较慢时，koff起主导作用；而当kon较快时，kon可延长体内药物-靶点复合物的寿命（受局部药物浓度影响）。体内药物-靶点复合物的最长寿命，源于选择性区域相关的非竞争性行为（快kon+慢koff），而非简单的竞争性行为（快kon+快koff或慢kon+快koff）。此外，快kon比慢kon更易引发受体再结合。这类动力学特征的重要性在治疗精神分裂症的多巴胺D2受体拮抗剂中得到充分证明：kon（而非koff）与靶点相关的锥体外系副作用相关。

体内活性研究

当一个分子被确定为具有开发潜力的先导化合物后，证明该分子能在体内与靶点发生真实作用就变得至关重要。体内分子评估包括研究药物在靶点所在部位的存在情况、靶点结合与停留时间（可能与体外结合及停留时间不同）、有效性，以及更复杂的药理学分析，以更清晰地界定候选药物的疗效。

靶点所在部位的药物存在情况

这涉及研究药物吸收和分布的药代动力学特征（药物能否到达体内合适区域），并确认药物存在于靶点所在部位。在此阶段，必须明确四个问题：1）给药剂量中，有多少药物被吸收？2）被吸收的药物在体内分布于何处？3）药物在体内能停留多久（清除情况）？4）需多久给药一次才能达到血浆稳态浓度？目前已有可预测这些药代动力学参数的低成本体外ADME测定方法，应用这些方法可降低临床试验中出现意外情况的风险。但对于候选新药而言，理解药代动力学参数及其对药物在体内到达靶点过程的影响至关重要。

体内靶点结合与停留时间

药物需在体内与治疗靶点结合才能发挥作用。例如，若药物体内半衰期长是由于分布容积极大，这种长半衰期并无实际意义——药物可能被隔离在脂肪组织等部位，导致治疗部位不存在药物。在此阶段，生物标志物十分重要，至少能表明药物存在于体内且在组织中与靶点发生了结合。同样关键的是，药物与靶点的结合时间需与产生治疗效果所需时间相匹配。如前文所述，这需要药物具备良好的药代动力学特征，且药物-靶点复合物具有理想的解离速率（koff）和结合速率（kon）。

有效性

以疗效为重点的临床试验（通常为II期）与以有效性为重点的临床试验（通常为III期）存在差异。疗效试验旨在确定药物在人体中是否具有活性，为检测这种活性，需使基线尽可能统一，通常通过选择范围狭窄的患者群体来实现。相比之下，有效性试验在异质性更强的患者群体中开展，以确定药物的真实治疗效果——在这种情况下，信号可能会在较高的背景噪音中消失。这是一个更严格的标准，也是许多药物研发失败的节点。

因此，开展有效性试验前需考虑的关键问题是：能否将靶点结合与药物产生的治疗性效应关联起来？这往往是将新分子与人体预期治疗效果联系起来的过程中最困难，但也最关键的步骤。

mGlu5正性变构调节剂（PAM）激动剂VU0092273的研究，便是体现药物存在、靶点结合与潜在治疗效用关联性的实例。利用mGlu5受体显像剂¹⁸F-FPEB标记小脑受体进行正电子发射断层扫描（PET），随后观察到VU0092273对其产生置换作用，表明该分子能与大脑中被认为与抗精神病活性治疗效应相关的区域（纹状体和小脑）的受体发生相互作用。而其与潜在治疗效用的关联则体现在：VU0092273在体内靶点所在关键区域达到结合浓度时，也能产生与治疗活性相符的效应。在该研究中，其可逆转苯丙胺诱导的过度运动，这被视为抗精神病活性的替代指标。

明确候选药物疗效的药理学分析

在特定功能测定中观察到的药物效应，可视为该药物在特定系统组合中作用的“快照”。而药物在体内的效应则应被看作一部完整的“电影”：药物会在不同基础活性和敏感性条件下接触多个功能系统，这给体外效应向体内条件的有效转化带来了挑战。

将药理学原理应用于先导化合物优化过程，有助于评估候选新药的潜在价值。药理学能够基于独立于系统的参数来表征化学物质改变生理功能的能力，因此可预测药物在多种组织中的体内治疗效应。基于此，亲和力、效能、α值（变构调节对亲和力的影响）、β值（变构调节对效能的影响）等系统独立参数，可用于药理学模型（如Black/Leff操作模型、功能性变构模型）中，以预测候选药物在不同组织中的活性。

例如，毒蕈碱受体PAM激动剂BQCA在不同敏感性组织中表现出不同特征，但可通过一组统一的分子活性参数进行建模，进而预测其在所有组织中的效应。具体而言，在三种敏感性不同的细胞系中，BQCA的作用存在差异：在一种细胞系中产生直接激动作用并增强乙酰胆碱的效应；在另一种细胞系中仅产生增强效应；在第三种细胞系中则增加乙酰胆碱的最大反应。但通过功能性变构模型（通过改变激动剂效能τA来设定不同的测定敏感性），这些不同表现均可通过一组系统独立的变构参数拟合：α=12（对亲和力的影响）、β=2（对效能的影响）、KB=5μM（亲和力）、τB（调节剂的直接效能，以乙酰胆碱效能的百分比表示）=1.4%。此类结果使药物化学家能专注于这组独立参数，而无需担心药物性质在不同组织中的具体表现。

将体外药物特征转化为体内特征时，另一有用原则是尽可能使用分子活性指标，而非复杂的系统行为指标。例如，激动剂效价是公认的激动剂活性指标，但效价是亲和力和效能两种分子特性的综合体现。具体而言，半数有效浓度（EC50，作为效价指标）是亲和力与效能的比值；在操作模型中，EC50=KA/(τA+1)，其中KA为激动剂-受体复合物的平衡解离常数（亲和力），τA为激动剂效能。

对选定为候选药物的分子进行药理学特性研究，是药物研发过程中至关重要的一步，原因有二。其一，可深入了解疾病状态、治疗需求以及分子在临床环境中的复杂行为。其二，能帮助项目团队为首个候选分子的失败做好准备。具体而言，若候选分子失败，可推进后续分子以挽救研发工作；同时，了解失败分子的一系列效能特征，有助于规避陷阱，避免后续分子重蹈覆辙，出现与失败分子相同的特性。

以下列举几个真实的化合物药理学特征分析案例，说明体外活性向体内活性转化过程中可能出现的解读偏差，以及如何规避这些偏差。

案例1：组胺H2受体阻滞剂长期用于溃疡治疗后失效

组胺H2受体阻滞剂在急性期可减少胃酸分泌并促进溃疡愈合，但研究发现部分H2阻滞剂在长期治疗后会丧失活性，这归因于H2受体在细胞表面的表达增加。这种失活现象在反向激动剂中出现，而在中性拮抗剂中未观察到。原因在于：尽管细胞持续合成受体，但反向激动剂会抑制细胞表面受体的活化（以及随后正常的受体内化）；而中性拮抗剂不会阻止受体的自发活化，也不会抑制受体内化。该案例表明，确定候选拮抗剂是否为反向激动剂具有重要价值。尽管并非所有反向激动剂都会产生耐受性，但了解这种可能性对分子的体内测试具有指导意义。

案例2：CCR5内化剂抗HIV-1感染活性失效（真实案例）

HIV-1通过与趋化因子受体CCR5相互作用感染细胞，因此CCR5内化是降低HIV-1感染的潜在机制。趋化因子可介导CCR5内化，但内化过程的结果存在差异。例如，趋化因子CCL5可快速介导受体内化，但受体随后会迅速循环回细胞表面，因此CCL5对HIV-1感染几乎无抑制作用；而另一种趋化因子AOP-RANTES可介导受体内化并将其导向细胞降解途径，从而阻止受体重新回到细胞表面。该案例表明，在生化测定中进一步表征内化受体的处置情况、阐明受体内化机制具有重要价值。

案例3：偏向性血管紧张素受体调节剂治疗心力衰竭失败（真实案例）

当药物具有多种精细调节的效能时，若临床试验未以正确结果为目标，就可能丧失其独特活性。TRV027（一种用于心力衰竭研究的偏向性血管紧张素II1型受体调节剂）的研发失败便是典型例子。在针对急性心力衰竭患者的IIb期随机、双盲、安慰剂对照剂量递增试验（BLAST-AHF）中，TRV027未显示出优越的疗效，这体现了偏向性从体外向体内转化的困难。尽管TRV027主要是血管紧张素受体拮抗剂（与已获批的心力衰竭药物氯沙坦类似），但其还具有额外效能（β-抑制蛋白激动作用），旨在数月内增强有益的心脏重构。然而，该试验设计为短期（48-96小时）输注TRV027，终点为评估30天后对症状和生存率的影响——这种设计无法检测到TRV027的独特活性。此外，患者群体的肾素-血管紧张素活性似乎未充分升高，这使得血管紧张素受体拮抗剂的任何益处都难以在这种阴性背景下显现。该案例说明，对特性略有差异的候选分子进行临床评估时，可能需要更高的敏锐度才能识别其独特价值。