NAR | 孙青原/欧湘红/孟铁刚/苏瑞宝团队揭示RNA G-四链体在卵子发育及雌性生殖中的作用及机制

在基因表达调控领域， RNA G- 四链体结构（ rG4s ）长期以来呈现出一个令人困惑的矛盾现象：体外高通量测序研究显示 rG4 在体外条件下广泛形成，但在活细胞内却主要处于解折叠状态；然而，细胞成像实验和内源基因表达研究却清晰展示了 rG4 的形成及其功能。这种“ 体外丰富 - 体内稀缺” 的矛盾提示， rG4 结构可能受到精密的动态调控，但这种调控的本质、分子机制及其生理病理意义尚不清楚。传统观点认为， RNA 解旋酶如 DHX36 的主要功能是解开 rG4 结构，但这一简单的 " 解旋酶 - 底物 " 模型难以解释细胞如何在需要时维持 rG4 的功能性存在。 卵子发育过程中，大量合成和储存 mRNA ，这些母源 mRNA 在卵母细胞成熟和早期胚胎发育中选择性表达、储存和降解， 为研究 rG4s 的功能提供了理想的模型。

近日，广东省第二人民医院 孙青原、欧湘红、孟铁刚、苏瑞宝 团队 在 Nucleic Acids Research 期刊上发表题为

Ultra-low-input rG4-seq reveals the RNA G-quadruplex regulome in gene expression and genome integrity

首先，研究团队开发了超低输入量 rG4 测序技术（ ULI-rG4-seq ），实现了从仅 100 个卵母细胞进行全转录组 rG4 图谱绘制的技术突破。现有 rG4 检测方法面临严重的技术瓶颈： rG4-seq 虽能提供全转录组图谱但需体外离子条件处理，可能无法反映生理状态； DMS 化学探针虽可直接检测细胞内状态但易受其他结构元件干扰； G4RP-seq 使用结构特异性探针和化学交联捕获生理性 G4 ，但对低丰度转录本敏感性不足——所有这些方法均需要大量起始材料（数百万细胞），限制了在珍贵临床样本或稀有细胞群体中的应用。

在卵子中， ULI-rG4-seq 捕获的 rG4 显著富集于关键调控区域，特别是转录起始位点（ TSS ）和转录终止位点（ TES ）附近。基因组分布分析显示 rG4 在 5'UTR （ 6.69% ）和 3'UTR （ 18.88% ）区域相对于其基因组大小呈现非随机分布，另外在外显子（ 49.35% ）和内含子（ 14.74% ）中也检测到丰富信号。这种策略性定位提示 rG4 可能作为结构开关，协调转录和转录后加工过程。 进一步的功能分析 揭示，含 rG4 的转录本显著富集于细胞稳态的基本生物学过程，包括 mRNA 加工、染色质修饰、细胞周期控制、翻译调控和 RNA 稳定性通路。

为阐明 rG4 调控的基本原理，研究团队选择了 DHX36 作为研究对象——这是一个保守的 rG4 解旋酶，在 RNA 结构调控中具有潜在作用。 研究团队建立 纯合 Dhx36 敲入小鼠模型（ Dhx36 ki/ki ），表达内源标签 DHX36-GFP 融合蛋白。该模型显示 DHX36 在整个发育过程中主要定位于细胞质，即使核输出抑制剂 等 处理后仍维持胞质定位，提示这是进化保守的机制。

最关键的发现：通过结合 DHX36-GFP 敲入模型与 Trim-away 技术实现急性蛋白降解，研究者揭示了 一个意外 现象—— DHX36 急性缺失（ Trim-away 3 小时内降解）导致 rG4 显著积累，而慢性缺失（ Dhx36 fl/ fl ;SKO 卵母细胞 ）引起 rG4 水平全局降低（ P < 0.0001 ）。这改变了对 DHX36 的 功能 认识： DHX36 不是简单解旋酶，而是 rG4 稳态的 " 双时相守护者 " ——既是即时解旋因子，又是长期水平维持者，揭示了细胞维持 RNA 结构平衡的精密反馈机制。

细胞质 DHX 36 如何指挥核内基因表达 呢？整合 DHX36 LACE-seq 和 ULI-rG4-seq 数据，鉴定出 3,405 个共享靶标（占 DHX36 结合转录本 79% ，含 rG4 转录本 62% ）。尽管 DHX36 主要定位于细胞质，其缺失却严重影响核内基因表达。全局转录分析显示 Dhx36 fl/fl ;SKO 卵母细胞转录活性显著降低（ P < 0.0001 ），但 RNA 聚合酶 II （ Pol II ）水平却升高，提示转录暂停。 Pol II CUT&Tag 分析证实， Dhx36 fl/fl ;SKO 卵母细胞在 TSS 处出现 Pol II 积累，在含 rG4 和 DHX36 结合的转录本中尤为明显。用 rG4 稳定剂 cPDS 处理对照卵母细胞完全重现了这一表型，建立了 rG4 结构与转录暂停的因果关系。机制研究揭示， DHX36 通过解开转录延伸正向因子（ P-TEF ）组分 CCNT1 和 TCEA1 转录本中的 rG4 结构，确保其高效翻译。尽管 Dhx36 fl/fl ;SKO 卵母细胞中总 Pol II 升高，延伸型 Pol II （ Ser2 磷酸化）及其激酶 CDK9 水平却降低（ P < 0.0001 ），表明转录延伸受损。 显微注射 RNaseH1 mRNA 或 α - 鹅膏蕈碱抑制转录均显著降低 R-loop 和γ H2AX 信号，建立因果关系。这揭示了机制级联： DHX36 依赖的 rG4 稳态维持→延伸因子适当表达→防止转录应激和 R-loop 形成→维护基因组完整性。

在生理水平上， DHX36 缺失的雌性小鼠卵子质量存在严重缺陷，大部分卵母细胞停滞在生发泡（ GV ）阶段，无法完成减数分裂成熟，丧失发育潜能。组织学分析揭示 DHX36 敲除小鼠卵泡储备加速耗竭，呈现典型卵巢早衰（ POF ）表型，完全不育。在哺乳动物体内建立了 RNA 结构稳态与女性生殖健康的直接因果关系。

综上所述， 本研究通过 ULI-rG4-seq 技术 在理论上 揭示了 DHX36 精密调控的 RNA G- 四链体结构动态维持新机制 ， 建立了关键概念：（ 1 ） RNA 结构调控的双时相特征；（ 2 ）跨区室调控机制；（ 3 ） RNA 结构作为多层次基因表达网络的主控开关；（ 4 ） RNA 结构稳态作为基因组完整性的上游保障。 同时也揭示了 rG4 在卵子发育、卵子质量控制及雌性生殖力维持中发挥重要作用。 这些进步不仅深化了对 RNA 调控的理解，也为理解卵巢早衰等生殖疾病提供了新视角，并为开发靶向 RNA 结构动态的治疗策略奠定了基础。

论文链接：https://doi.org/10.1093/nar/gkag040

制版人：十一

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