Adv Sci丨朱健康、梁亚峰、刘朋朋团队开发出几乎无PAM限制的CRISPR-Cas工具

自 CRISPR-Cas 系统被发现并发展为可编程的基因编辑工具以来，它便以 “ 精准、便捷、可扩展 ” 的特性迅速席卷生命科学领域，被誉为 21 世纪最具颠覆性的技术突破之一。它像一把能够 “ 按需定位 ” 的分子剪刀 —— 既能在基因组中精准找到目标序列，也能实现高效切割与改写，因此常被形象地称为 “ 上帝的剪刀 ” 。这项革命性技术在 2020 年获得诺贝尔化学奖的权威认可， 2023 年底，首款基于 CRISPR 的基因编辑疗法更是正式获 FDA 批准上市，用于治疗镰状细胞病和 β- 地中海贫血。 CRISPR 正以前所未有的速度重塑改造生命的方式，并持续推动基因编辑迈向更广阔、更自由的应用边界。

CRISPR-Cas 可以理解为一套 “ 可编程的分子导航系统 ” ： Cas 核酸酶在向导 RNA （ gRNA/crRNA ）的指引下，精准定位到目标 DNA 序列并完成切割，实现基因改写。然而，几乎所有天然 Cas 都必须先识别目标序列旁的一段短序列 ——PAM （ protospacer adjacent motif ）。 PAM 显著压缩了可操作的基因组空间。因此， “ 拓宽 PAM 识别范围 ” 成为近年基因编辑工具进化的核心方向，但往往伴随活性或特异性的权衡【1-7】。值得关注的是，朱健康团队在 2024 年就报道了工程化 Cas12i 核酸酶 SF01【8】，可识别 TTN ，并在动物与植物中实现高效编辑；但 TTN 的 PAM 需求限制了其应用。

近日，南方科技大学朱健康、梁亚峰、刘朋朋在Advanced Science杂志上发表了题为Structure-Guided Engineering of a Cas12i Nuclease Unlocks Near-PAMlessGenome Editing的文章。团队进一步采用结构导向策略对SF01工程化改造，获得KR、IKRR、STKRR三个关键变体，它们表现出显著放松的PAM特异性（5‘-NNTN-3’）。这种近乎无PAM的性能将基因组的靶向部分扩展到25%以上，是SF01的四倍。此外，用这些变体构建的腺嘌呤碱基编辑器在内源性位点实现了高效编辑 ( 约 80%) 。使用 GUIDE-tag 和 Digenome -seq 进行的全面脱靶分析显示了变体的高精准性。这些工程化核酸酶有力补充了基因组编辑工具包，使得以前由于 PAM 限制而无法编辑的应用场景成为可能。

团队以结构为导向，选择了 PAM 相互作用界面上 38 个氨基酸残基进行了半饱和突变、叠加等多轮工程化改造得到了 D293K_E494R (KR) ， T208I_D293K_V460R_E494R (IKRR) 和 E5S_E179T_D293K_V460R_E494R (STKRR) 三个变体。并从体外、细胞水平分别验证了变体只需要 “T” 的 PAM 特性。

团队还扩展了以变体为基础的基因编辑工具包 —— 腺嘌呤碱基编辑器 ABE ，均在非常规 PAM “NNTN” 上也表现 出较高 编辑效率 ( 约 80%) 。与其他 PAM 灵活的编辑工具 AsCas12a 、 enAsCas12a 、 SpRY 和 SpCas9 variant (MRRWMR) 相比，团队开发的变体显示出更纯的等位基因编辑性能。 此外，团队 还 结合 GUIDE-tag 和 Digenome -seq 两种方法全面评估了变体的安全性 。 SF01 变体在显著提升靶向活性的同时，实现了更广泛的 PAM 兼容性，且保持了高全基因组特异性 ，为 治疗和精准 编辑 研究领域 提供了强有力的工具。

南方科技大学前沿生物技术研究院的陈琪通 博士研究生 和苟涵麟 博士研究生 为论文的共同第一作者。朱健康、梁亚峰和刘朋朋博士为通讯作者。

原文链接： https://advanced.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202516670

撰文丨陈琪通

制版人：十一

参考文献

1. Kim, D., et al., Evaluating and Enhancing Target Specificity of Gene-Editing Nucleases and Deaminases.Annu Rev Biochem, 2019. 88 : p. 191-220.

2. Kleinstiver, B.P., et al., Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities.Nature, 2015. 523 (7561): p. 481-5.

3. Walton, R.T., et al., Unconstrained genome targeting with near-PAMless engineered CRISPR-Cas9 variants.Science, 2020. 368 (6488): p. 290-296.

4. Toth, E., et al., Improved LbCas12a variants with altered PAM specificities further broaden the genome targeting range of Cas12a nucleases.Nucleic Acids Res, 2020. 48 (7): p. 3722-3733.

5. Ma, E., et al., Directed evolution expands CRISPR-Cas12a genome-editing capacity.Nucleic Acids Res, 2025. 53 (13).

6. Kleinstiver, B.P., et al., Engineered CRISPR-Cas12a variants with increased activities and improved targeting ranges for gene, epigenetic and base editing.Nat Biotechnol, 2019. 37 (3): p. 276-282.

7. Kleinstiver, B.P., et al., Publisher Correction: Engineered CRISPR-Cas12a variants with increased activities and improved targeting ranges for gene, epigenetic and base editing.Nat Biotechnol, 2020. 38 (7): p. 901.

8. Duan, Z., et al., An engineered Cas12i nuclease that is an efficient genome editing tool in animals and plants.The Innovation, 2024. 0 .

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