干货：染色质免疫共沉淀（ChIP）实验深度揭秘

简介
染色质免疫沉淀（ChIP）技术，是表观遗传学研究里的 “明星方法”，能快速锁定蛋白质和 DNA 的结合位点，揭开二者互作的神秘面纱。

这项技术的底层逻辑是抗原抗体的特异性识别：用特定抗体 “钓取” 目标 DNA 结合蛋白，同时把它结合的 DNA 片段一起富集起来，最终就能在全基因组层面，搞清楚细胞或组织里蛋白质和 DNA 到底是怎么 “互动” 的。

技术原理
ChIP 技术的关键在于 “锁住” 蛋白质和 DNA 的真实结合状态：先在细胞正常生长的条件下，用化学试剂把 DNA 和结合在上面的蛋白质 “粘” 在一起，避免后续操作中二者分离；接着用超声或酶把缠结的染色质剪成小段，方便后续精准筛选；再用专门识别目的蛋白的抗体，把 “蛋白 - DNA” 复合物 “抓” 出来，实现特异性富集。

整个实验要经过细胞固定、染色质剪碎、免疫沉淀、解除交联、DNA 提纯、DNA 检测这几步。不过因为步骤多、每一步的操作细节都容易影响结果，所以做实验时一定要设置对照，而且得结合经验判断结果是否可靠，这样才能避免实验白做。

研究意义

核酸与蛋白质作为生命活动的核心生物大分子，二者之间的动态相互作用是调控各类生命进程的基础，贯穿细胞生长、增殖、分化、遗传信息传递及代谢稳态维持等关键生理过程。深入解析蛋白质与核酸的互作机制，是揭开生命现象本质、阐明疾病发生发展分子机理的核心突破口。而染色质免疫沉淀（ChIP）技术，凭借其能在生理状态下捕获蛋白质与DNA天然结合状态的优势，成为表观遗传学及分子生物学领域中，研究蛋白质-DNA互作关系、挖掘基因表达调控网络的核心工具，为疾病机制研究、药物靶点筛选等提供了重要技术支撑。

实验材料

一、核心器材

静音混合器、高速低温离心机、超声破碎仪、电泳仪、水平电泳槽、普通PCR仪、实时荧光定量PCR仪（Real-time PCR仪）。

二、试剂与耗材

1. 细胞样本：HeLa细胞；

2. 缓冲液及基础试剂：HEPES、NaCl、KOH、HCl、Triton X-100、NP-40、十二烷基硫酸钠（SDS）、NaHCO₃、去氧胆酸钠、乙二胺四乙酸（EDTA）、Tris缓冲液、蛋白酶抑制剂混合物、蛋白酶K；

3. 免疫沉淀相关试剂：Protein A/G磁珠（预结合鲑精DNA封闭）；

4. 对照及检测试剂：GAPDH对照引物、阳性对照抗体（乙酰化组蛋白H3抗体，Anti-Acetyl Histone H3）、阴性对照抗体（正常家兔IgG，Normal IgG）；

5. 核酸检测试剂：琼脂糖、PCR反应Mix、SYBR Green qPCR Mix。

三、实验步骤

ChIP实验核心流程可分为试剂配制、细胞固定、染色质断裂、免疫沉淀等关键环节，其中试剂配制与细胞固定是保障实验成功的基础，具体操作如下：

（一）试剂配制

所有缓冲液需提前配制并调节至对应pH值，蛋白酶抑制剂需临用前新鲜加入，避免酶解目标蛋白，具体配方如下：

（1）裂解缓冲液（FA Lysis Buffer）：50 mmol／L HEPES-KOH（pH 7.5）、140 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA（pH 8.0）、1％ Triton X-100、0.1％ 去氧胆酸钠、0.1％ SDS，临用前加入适量蛋白酶抑制剂。

（2）RIPA缓冲液：50 mmol／L Tris-HCl（pH 8.0）、150 mmol/L NaCl、2 mmol/L EDTA（pH 8.0）、1% NP-40、0.5％ 去氧胆酸钠、0.1％ SDS，临用前加入适量蛋白酶抑制剂。

（3）漂洗缓冲液（Wash Buffer）：0.1％ SDS、1％ Triton X-100、2 mmol/L EDTA（pH 8.0）、150 mmol/L NaCl、20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）。

（4）最终漂洗缓冲液（Final Wash Buffer）：0.1％ SDS、1% Triton X-100、2 mmol/L EDTA（pH 8.0）、500 mmol/L NaCl、20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）。

（二）细胞固定

细胞固定的核心是在生理状态下交联DNA与蛋白质，维持二者天然结合状态，操作需轻柔以避免细胞破裂，步骤如下：

（1）取直径150 mm培养皿，待培养的HeLa细胞汇合度达80%~90%（细胞数量约1×10⁷个）时进行实验；向培养皿中20 ml培养基内，加入550 μl 37%甲醛（或1100 μl 18.5%甲醛），使甲醛终浓度为1%。

（2）轻柔晃动培养皿混匀，室温孵育10 min，确保交联充分且均匀。

（3）终止交联：加入甘氨酸至终浓度125 mmol／L，轻柔混匀后室温孵育5 min，彻底终止甲醛的交联作用。

（4）将培养皿转移至冰上预冷，抑制细胞内源性酶活性，防止目标复合物降解。

（5）小心吸尽培养基，加入20 ml冰冷的PBS，轻柔清洗细胞表面残留培养基及试剂。

（6）吸尽PBS，重复上述PBS清洗步骤1次，确保清洗彻底。

（7）加入2 ml含1×蛋白酶抑制剂复合物的冰冷PBS，用细胞刮刀沿培养皿壁轻柔刮取细胞，收集至1.5 ml离心管中。

（8）置于高速低温离心机，1000 g、4 ℃条件下离心5 min，收集细胞沉淀。

（9）吸弃上清液，向细胞沉淀中加入750 μl预冷的FA Lysis缓冲液，轻柔吹打重悬细胞，获得细胞裂解液，后续用于染色质断裂步骤。

（三）染色质断裂

（1）将含细胞裂解液的离心管置于冰上，进行超声破碎。超声参数设定为：功率310 W，冲击20 s，间隔2 s，共进行3个循环。需注意，超声条件具有细胞系特异性，且与细胞数量密切相关，需通过预实验摸索确定最优条件。超声过程中，将探头尽量深入管内，但避免接触管底及侧壁，防止产生泡沫影响实验效果。

（2）超声破碎完成后，于4 ℃、10,000 g条件下离心10 min，去除细胞碎片等不溶性杂质。

（3）小心吸取上清液，分装至新的1.5 ml离心管中，每管50 μl，分装后可置于-80 ℃冰箱保存，保存期最长不超过3个月。

（4）取100 μl超声破碎产物，加入5 μl浓度为20 mg/ml的蛋白酶K，于65 ℃条件下旋转混匀，进行解交联反应，反应时长为4~5 h（或过夜）。反应结束后，取一半样品进行酚-氯仿抽提，后续通过1.5%琼脂糖凝胶电泳检测超声破碎效果，确保染色质片段符合实验要求。

（四）染色质免疫沉淀

（1）将每管50 μl的超声破碎产物按1:10比例稀释，加入450 μl RIPA缓冲液，轻轻混匀。从中吸取5 μl（占总体积的1%）作为Input对照，置于4 ℃保存，备用（用于后续第4步验证）。

（2）向每个样品管中分别加入阳性对照抗体、阴性对照抗体（正常IgG）及目标蛋白抗体，抗体用量范围为1~10 μg。由于抗体的效力、纯度及特异性存在差异，建议通过抗体梯度稀释实验，确定该实验体系的最适抗体用量。

（3）向各管中加入20 μl充分混匀的Protein A／G beads（预结合鲑鱼精DNA，Salmon Sperm DNA），轻柔混匀。

（4）置于4 ℃环境中旋转孵育1 h（或过夜），确保抗体与抗原及beads充分结合形成免疫复合物。

（5）孵育结束后，于2000 g条件下离心1 min，小心弃去上清液，保留beads复合物。

（6）用1 ml Wash缓冲液清洗beads，共清洗3次，每次清洗后于2000 g离心1 min，弃去上清液，彻底去除未结合的杂蛋白及杂质。

（7）最后用1 ml Final Wash缓冲液清洗beads 1次，2000 g离心1 min，弃去上清液，完成beads纯化。

（五）解交联反应和DNA的纯化

通过蛋白酶K介导的解交联反应释放结合的DNA，随后采用酚-氯仿抽提结合乙醇沉淀法纯化DNA，或直接使用DNA纯化柱回收DNA，具体步骤如下：

（1）向每份样品（含Input对照组）中加入120 μl Elution缓冲液，置于30 ℃环境中旋转孵育15 min，使DNA从免疫复合物中洗脱。

（2）于2000 g条件下离心1 min，收集上清液。

（3）将上清液转移至新的离心管中，可暂时置于-20 ℃保存。

（4）向各管中加入5 μl浓度为20 mg/ml的蛋白酶K，65 ℃条件下旋转混匀，进行二次解交联反应，时长4~5 h（或过夜），确保交联完全解除。

（5）对解交联后的样品进行酚-氯仿抽提，后续通过乙醇沉淀法纯化DNA，纯化后加入100 μl无菌水溶解DNA，置于-20 ℃保存备用。

（六）DNA的鉴定

ChIP实验回收DNA的常用鉴定方法为半定量PCR和实时荧光定量PCR（Real-time PCR），可通过扩增特异性靶序列验证实验有效性及富集效率。

（七）实验结果及分析

（1）交联后的染色质经超声断裂后，通过2%琼脂糖凝胶电泳分析，合格的破碎效果应满足：染色质片段平均长度在200~1000 bp之间，片段分布均匀，无明显拖尾或大片段残留。

（2）对纯化后的DNA片段进行PCR扩增验证，选取管家基因GAPDH的启动子区作为扩增靶序列（扩增片段大小为165 bp）。理想结果为：阳性对照及Input对照均能检测到清晰的扩增条带，无DNA模板的空白对照无扩增条带，阴性对照（正常IgG）可出现微弱扩增条带，但条带亮度与阳性对照存在显著差异，表明实验特异性良好。

注意事项

（1）甲醛交联时间需通过预实验确定，因其受细胞类型、细胞数量影响较大。交联时间过长会导致实验材料丢失，且增加超声破碎难度；交联时间过短则会造成交联不完全，影响免疫沉淀效果。

（2）超声破碎通过机械力断裂染色质，过程中易产生热量及泡沫，导致蛋白质变性，降低ChIP效率。因此，超声操作需全程在冰上进行，采用时断时续的超声程序，避免长时间连续超声，防止蛋白质降解及染色质结构破坏。

（3）ChIP实验需设置完善的对照体系，缺少对照会无法评估实验结果的可靠性。阳性抗体对照、阴性抗体（正常IgG）对照为基础对照；Input对照不仅可验证染色质破碎效果，还能根据Input及沉淀样品中靶序列的含量，按取样比例计算ChIP富集效率，是实验有效性验证的关键。

（4）目标蛋白抗体的选择是ChIP实验成功的核心。蛋白质与染色质交联后，抗体的抗原表位可能被掩盖（与染色质结合位点过近），导致抗体无法识别，影响免疫复合物形成。因此，并非所有抗体均适用于ChIP实验，需选用经ChIP实验验证合格的抗体，以保障实验结果的准确性和可靠性。