三体|PCR实验中避免污染的关键策略

PCR（聚合酶链式反应）因其高灵敏度，极易受到实验环境中核酸污染的干扰，导致假阳性结果。污染来源包括前次PCR产物、气溶胶、试剂或仪器表面残留的DNA等。为确保实验结果的可靠性，需从实验设计、操作规范和环境控制三方面构建污染防控体系。本文系统阐述PCR实验中避免污染的核心策略。

一、实验分区：物理隔离污染源

1. 三区独立设置
   将实验流程划分为三个独立区域：
   • 试剂准备区：用于配制PCR反应体系（如引物、dNTP、缓冲液等），需严格无菌操作，避免引入外源DNA。
   • 样本处理区：进行核酸提取、加样等操作，需与试剂准备区物理隔离，防止样本交叉污染。
   • PCR扩增区：专用于PCR仪运行及产物分析（如电泳、测序），需与前两区完全隔离，避免扩增产物反向污染。
2. 单向流动原则
   实验人员、试剂和样本的流动方向应严格遵循“试剂准备区→样本处理区→PCR扩增区”的单向路径，禁止逆向操作或重复使用耗材（如移液器吸头、离心管）。

二、操作规范：细节决定成败

1. 使用带滤芯的移液器吸头
   普通吸头在吸液和排液时可能产生气溶胶，而滤芯吸头（如Axygen、Eppendorf品牌）可有效拦截气溶胶，防止其进入试剂或样本中。实验中需确保吸头与移液器紧密匹配，避免漏液。
2. 预分装试剂与“无模板对照”
   • 将引物、dNTP等试剂预分装为小份（如0.2 mL PCR管），避免反复冻融导致降解或污染。
   • 每批次实验设置“无模板对照”（NTC），即不加模板DNA的反应体系，用于检测试剂或环境中的污染。若NTC出现扩增条带，需立即排查污染源。
3. 闭管操作与快速处理
   • 核酸提取和加样过程应在生物安全柜内完成，并保持柜门关闭以减少气溶胶扩散。
   • 操作需迅速，避免长时间开盖导致气溶胶积累。例如，加样后立即盖紧PCR管，减少暴露时间。

三、环境控制：全方位阻断污染路径

1. 定期清洁与紫外线消毒
   • 实验台面、移液器、离心机等设备需用75%乙醇或核酸清除剂（如DNA Away）擦拭，去除表面残留DNA。
   • 每日实验结束后，开启超净工作台或生物安全柜的紫外线灯照射30分钟以上，破坏潜在核酸污染。
2. 使用UNG酶防交叉污染
   在PCR反应体系中加入尿嘧啶DNA糖基化酶（UNG酶），可降解前次PCR产物中的尿嘧啶（U）。UNG酶在预变性步骤（95℃）中被灭活，不影响当前反应，但能有效防止携带污染（Carryover Contamination）。
3. 专用设备与耗材管理
   • PCR仪、离心机等设备应专用，避免与其他实验共用。
   • 耗材（如PCR管、吸头）需选择无DNA酶/RNA酶认证的产品，并一次性使用，禁止重复灭菌。

四、应急处理：污染后的补救措施

若实验出现假阳性，需立即停止实验并排查污染源：

1. 更换所有试剂（包括引物、dNTP、缓冲液）和耗材。
2. 彻底清洁实验区域，并用核酸清除剂处理。
3. 重新设计引物或调整反应条件（如提高退火温度），降低非特异性结合风险。

结语

PCR污染防控需贯穿实验全流程，从物理分区、规范操作到环境控制，每一环节均需严格把控。科研人员应树立“预防优于治理”的意识，将污染防控作为PCR实验的标准流程，以保障实验结果的准确性与可重复性。