微生物平板划线操作指南

一、前言：平板划线的科研价值与核心痛点

在微生物菌种纯化、单菌落筛选等实验中，平板划线是获取纯培养物的核心技术 —— 某菌株鉴定实验因杂菌污染，导致 16S rRNA 测序结果错误；某抗生素筛选课题因划线重叠，单菌落获取率不足 30%，延误活性验证进度。这类问题并非技术难度高，多是对 “无菌控制、划线手法、冷却时机” 的细节把控不足。

平板划线看似 “步骤简单”，实则 80% 的研究生存在 “操作盲区”：接种环冷却不足烫死菌种、无菌区意识薄弱引入杂菌、划线力度不均导致培养基划破。本文结合 15 年微生物实验经验与国标要求，从无菌准备到结果验证，拆解全流程避坑要点，帮研究生避开 “分离失败” 与 “菌种污染”，让平板划线既高效又精准。

二、操作前准备：筑牢无菌 “第一道防线”

（一）器材灭菌与摆放：避免源头污染

1. 核心器材灭菌：

◦ 接种环：需在 121℃高压蒸汽灭菌 20 分钟，或使用一次性无菌接种环（开封后 4 小时内使用）；

◦ 培养基平板：灭菌后需倒置冷却至室温（25±2℃），检查平板是否有冷凝水（若有，需在超净台内开盖静置 10 分钟沥干，避免冷凝水冲刷菌落）；

◦ 菌种试管：管口需用无菌棉塞密封，使用前需在酒精灯外焰快速过焰灭菌（避免棉塞污染）。

1. 超净台准备：

◦ 提前 30 分钟开启紫外灯灭菌，同时打开风机（风速≥0.3m/s），灭菌后关闭紫外灯，通风 15 分钟（避免臭氧残留影响菌种活性）；

◦ 器材摆放：将酒精灯置于操作区中心，菌种试管、培养基平板、酒精棉球、废液烧杯按 “使用顺序” 呈扇形摆放，确保手臂移动时不跨越无菌区（酒精灯外焰 35cm 范围内）。

（二）人员防护与手部消毒：杜绝人为污染

1. 防护穿戴：穿戴无菌实验服、一次性手套（戴两层，内层丁腈手套防化学腐蚀，外层乳胶手套防交叉污染），长发需束起，避免头发掉落污染平板；

2. 手部消毒：用 75% 酒精棉球擦拭双手（从指尖到手腕，反复 3 次），再擦拭超净台台面（以酒精灯为中心，擦拭出 30cm×30cm 的无菌操作区），用过的酒精棉球需放入专用废液烧杯，不可随意丢弃。

三、标准操作 6 步流程：每步都有 “避坑点”

（一）点燃酒精灯：界定无菌核心区

1. 正确操作：打开酒精灯盖，用打火机从侧面点燃（避免正面点火导致火焰灼伤），将盖子扣放在远离操作区的台面（盖子内侧朝上，防止污染）；

2. 无菌区界定：酒精灯外焰 35cm 范围内为无菌区，所有操作（取菌种、划线、盖皿盖）需在此范围内完成，手臂不可跨越火焰上方，避免气流扰动破坏无菌环境；

3. 异常处理：若酒精灯火焰过小（＜3cm），可轻轻调节灯芯（不可用手直接触碰），火焰过大时需减小灯芯露出长度，避免灼伤器材或培养基。

（二）灼烧接种环：彻底灭菌，防残留

接种环灼烧不彻底是杂菌污染的主要源头，需严格遵循 “全金属红透” 原则：

1. 灼烧顺序：右手持接种环，先将金属丝部分置于外焰（温度最高，约 800℃）灼烧至红透（持续 3-5 秒），再倾斜接种环，灼烧金属杆部分（从连接处向手柄方向灼烧，长度约 2cm），确保无残留菌种；

2. 冷却控制：灼烧后不可立即接触菌种或培养基，需在无菌区自然冷却 30-60 秒（或轻轻触碰培养基边缘，无 “滋滋” 声即冷却到位），冷却不足会导致菌种死亡率超 60%，冷却过久则可能引入空气杂菌；

3. 重复灼烧：每次划线结束后，需重新灼烧接种环（流程同上），再进行下一区划线，避免跨区污染。

（三）取菌种：轻取少蘸，防损伤

取菌种时需避免 “用力刮擦” 导致培养基脱落或菌种过量，操作要点：

1. 试管操作：左手持菌种试管底部，将试管口置于酒精灯外焰无菌区，用右手小指轻轻拔出棉塞（棉塞末端不可触碰试管口外侧或台面）；

2. 取菌技巧：将冷却后的接种环伸入试管，轻轻接触培养基表面（不可插入过深，避免划伤培养基），蘸取少量菌种（肉眼可见 “细小白点” 即可，过量会导致划线重叠，无单菌落）；

3. 管口灭菌：取出接种环后，将试管口在酒精灯外焰快速过焰 2-3 次（杀灭管口杂菌），再将棉塞塞回试管（棉塞需塞紧，避免松动导致污染），试管放回原位时需标注 “已取菌”，避免重复使用。

（四）平板划线：手法精准，防重叠

划线手法直接决定单菌落获取率，需根据菌种特性选择 “一区法” 或 “三区 / 四区法”，核心是 “线密不叠、划至边缘”：

（1）一区法：适用于低浓度菌种（如纯培养物传代）

1. 操作流程：左手取培养基平板，用拇指和食指轻轻捏住皿盖边缘，其余手指托住皿底，将皿盖打开至 30°（开口过大易引入杂菌）；

2. 划线技巧：将接种环上的菌种在平板一侧轻轻接触，以 “蛇形” 连续划线，线与线间距 1-2mm（紧密但不重叠），划线范围需覆盖平板 2/3 区域，边缘需划至培养皿内缘（避免边缘漏划导致菌种浪费）；

3. 盖皿要求：划线结束后，立即盖上皿盖（动作轻柔，避免培养基晃动），倒置放入培养箱（防止冷凝水滴落冲刷菌落）。

（2）三区 / 四区法：适用于高浓度菌种（如土壤、食品样品）

1. 分区划线：

◦ 第一区：用蘸取菌种的接种环划 “蛇形线”（约占平板 1/4），划线后灼烧接种环冷却；

◦ 第二区：将接种环在第一区末端轻轻接触（沾取少量菌种），划第二区 “蛇形线”，与第一区重叠 1-2 条线（不可过多重叠，否则无单菌落），灼烧接种环冷却；

◦ 第三区 / 第四区：重复第二区操作，每区与前一区重叠 1-2 条线，最终在最后一区形成稀疏单菌落；

1. 关键提醒：划线时力度需均匀，接种环与培养基表面夹角保持 45°（角度过大易划破培养基，角度过小导致划线过浅，菌种附着不足）。

（五）培养：温湿度适配，防菌落蔓延

不同微生物的培养条件差异显著，选错条件会导致单菌落形态异常或蔓延：

（六）结果观察与判断：单菌落合格标准

划线后需按 “三看” 原则判断结果是否合格，避免无效实验：

1. 看杂菌：平板上应只有目标菌落（形态一致，如大肠杆菌为圆形、乳白色），若出现形态不同的菌落（如红色、不规则形），说明存在杂菌污染，需重新划线；

2. 看单菌落：最后一区（三区 / 四区法）需有 10 个以上单菌落，单菌落需边缘清晰、大小均匀，无重叠或蔓延（若单菌落不足 5 个，说明划线时菌种蘸取过少或灼烧后冷却不充分）；

3. 看划线轨迹：划线轨迹应平直、连续，无培养基划破痕迹（划破会导致菌种聚集，无单菌落），若轨迹断裂，需检查接种环是否过粗或力度过大。

四、常见问题处理：精准解决实操痛点

（一）杂菌污染：3 步溯源与防控

杂菌污染是平板划线最常见问题，需按 “源头 - 操作 - 环境” 三级排查：

1. 源头排查：检查菌种试管是否污染（取少量菌种涂片镜检，观察是否有杂菌）、培养基是否灭菌彻底（空白平板培养后无菌落为合格）、接种环是否灼烧到位（确保全金属红透）；

2. 操作排查：回顾是否有 “非无菌操作”（如手臂跨越火焰、皿盖开口过大、棉塞触碰台面），需严格遵循 “无菌区操作” 原则，减少不必要的动作；

3. 环境排查：检测超净台洁净度（用沉降法检测，平板菌落数＜3 CFU / 皿・30 分钟为合格），若环境菌落数超标，需更换超净台滤网或消毒后再使用。

（二）单菌落少或无：4 个关键改进点

1. 菌种浓度调节：若菌种浓度过高（如土壤样品），需先稀释（用无菌生理盐水稀释 10-100 倍）再划线，避免划线时菌种过量导致重叠；

2. 冷却时间控制：灼烧后的接种环冷却时间不足会烫死菌种，可延长冷却时间至 60 秒，或在无菌区轻轻触碰无菌培养基（无响声即可）；

3. 划线力度调整：力度过轻会导致菌种附着不足，需适当加大力度（以接种环轻轻压入培养基表面 0.1mm 为宜），确保菌种有效转移；

4. 培养条件优化：若目标菌为厌氧菌（如乳酸菌），需在厌氧培养箱中培养，常规需氧培养会导致菌种不生长，无单菌落。

五、实验小贴士与参考资料

（一）实验小贴士（科研经验总结）

• 新手练习技巧：先用无菌水替代菌种，练习三区划线手法（重点掌握 “冷却时机” 与 “划线力度”），熟练后再用实际菌种操作，减少菌种浪费；

• 接种环选择：分离细菌用直径 0.5mm 的细接种环（划线更细，易形成单菌落），分离霉菌用直径 1mm 的粗接种环（霉菌菌丝粗，需较粗接种环转移）；

• 结果验证需求：若单菌落用于关键实验（如基因克隆、药敏试验），可依托科易猫科研检测 —— 其标准化菌种鉴定流程（如 16S rRNA 测序、生化反应验证）能确认单菌落纯度，避免杂菌干扰实验结果。

（二）参考资料

[1] GB 4789.28-2024 食品安全国家标准 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求（国家标准）

[2] GB 4789.1-2020 食品安全国家标准 食品微生物学检验 总则（国家标准）

[3] 《微生物学实验教程》（高等教育出版社，2024 年版）

[4] 平板划线法单菌落分离常见误区与解决策略（《微生物学通报》，2023 年第 50 卷）

[5] 《微生物菌种分离与纯化技术手册》（化学工业出版社，2022 年版）

六、总结

平板划线的核心是 “无菌控制 + 精准手法”—— 从接种环的彻底灼烧，到划线时的力度与间距，再到培养条件的适配，每一步都直接影响单菌落分离结果。研究生需摒弃 “简单操作无需重视” 的误区，将规范流程融入实验全流程，才能避免 “反复划线” 与 “菌种污染”。

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