IF专题| IF自发荧光你了解吗？

经常做IF的小伙伴，有没有遇到过这样的情况，IF实验背景高，只孵了荧光二抗的阴性对照，还是有星星点点的背景荧光。

一开始怀疑是封闭没封好

使用二抗同种属来源的血清进行了一波加强封闭后，阴性对照还是有星星点点的背景荧光！

然后开始怀疑是一抗不特异，更换一抗后，发现可怕的星星点点居然还在！（一脸惊讶）

最后目光转向荧光二抗已经开始怀疑荧光抗体质量差、非特异性结合严重！（多少带点小暴躁，我要找试剂商售后！）

稳住！这有可能是样本的自发荧光哦，可以通过设置一个空白对照，即不孵育任何抗体，直接将处理好的样本放在各个通道下观察情况，排除样本的自发荧光。

关于IF样本自发荧光你了解多少

常见自发荧光类型

交联固定诱导自发荧光

使用福尔马林、戊二醛等醛类固定剂，通过与蛋白质之间共价结合作用，将细胞组织结构固定为形态稳定的不溶性网状物。其中的醛会与胺结合形成席夫碱，导致自发荧光（戊二醛 > 多聚甲醛 > 甲醛）。

这种因交联剂固定产生的自发荧光具有广泛发射光谱，在蓝色，绿色和红色光谱范围内均可检测到信号，是最为常见的样本自发荧光类型。

解决措施：可换用醇类固定剂去除自发荧光。

内源性物质自发荧光

组织中的存在多种天然化合物，也会自发荧光。

如红细胞中的血红素基团由于其卟啉环结构而呈现红色自发荧光；

脂褐素是一种颗粒状的亲脂性色素，随着年龄增长会在骨骼肌，神经元和心脏等许多组织细胞中聚集，在500-695nm处发光最强烈。除此之外还有核黄素、弹性蛋白等也是产生自发荧光的大户。

解决措施：

对于血红素基团自发荧光可在组织固定之前，先用 PBS 灌注组织，洗去大量红细胞，从而降低血红素自发荧光干扰。

由脂褐素产生的自发荧光，可以通过苏丹黑 B 处理，苏丹黑 B 具有疏水性，而脂褐素颗粒是由溶酶体消化的脂质残基组成，故苏丹黑 B 能有效结合富含脂质的脂褐素颗粒而掩盖其自发荧光。需要注意的是苏丹黑 B 会在远红光通道中发出荧光，因此在进行多重染色时须考虑到这一点。

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