曾获诺贝尔奖的固相多肽合成是啥？应用中会有哪些问题？

一、定义与核心概念

固相合成（Solid-Phase Synthesis, SPS）是一种在固相载体上逐步构建有机分子的化学合成方法，尤其以固相多肽合成（ solid phase peptide synthesis, SPPS）最为著名。其核心原理是将目标分子的第一个单体（如氨基酸）通过化学键固定在不可溶的树脂载体上，随后依次添加后续单体，并通过重复的脱保护、偶联和洗涤步骤完成链式延伸，最终切割树脂得到目标产物，此反应极大的减小了多肽合成的难度。固相肽合成是肽合成化学的重要突破。其主要特点是无需纯化中间产物，合成过程可以连续进行，为多肽合成的自动化奠定了基础。目前多肽的全自动合成基本上是固相合成。

二、发展脉络

1、奠基阶段 ----- 多肽合成研究已经走过了一百多年的光辉历程。1902年，Emil Fischer首先开始关注多肽合成，由于当时在多肽合成方面的知识太少，进展也相当缓慢，直到1932年，Max Bergmann等人开始使用苄氧羰基(Z)来保护α-氨基，多肽合成才开始有了一定的发展。

到了20世纪50年代，有机化学家们合成了大量的生物活性多肽，包括催产素，胰岛素等，同时在多肽合成方法以及氨基酸保护基上面也取得了不少成绩，这为后来的固相合成方法的出现提供了实验和理论基础。

1963年，Merrifield首次提出了固相多肽合成方法(SPPS)，这个在多肽化学上具有里程碑意义的合成方法，一出现就由于其合成方便，迅速，成为多肽合成的首选方法，而且带来了多肽有机合成上的一次革命，并成为了一支独立的学科——固相有机合成(SPOS)。因此，Merrifield荣获了1984年的诺贝尔化学奖。Merrifield经过了反复的筛选，最终摒弃了苄氧羰基(Z)在固相上的使用，首先将叔丁氧羰基(BOC)用于保护α-氨基并在固相多肽合成上使用，同时，Merrifield在60年代末发明了第一台多肽合成仪，并首次合成生物蛋白酶，核糖核酸酶(124个氨基酸)。

1972年，Lou Carpino首先将9-芴甲氧羰基(FMOC)用于保护α-氨基，其在碱性条件下可以迅速脱除，10min就可以反应完全，而且由于其反应条件温和，迅速得到广泛使用，以BOC和FMOC这两种方法为基础的各种肽自动合成仪也相继出现和发展，并仍在不断得到改造和完善。同时，固相合成树脂，多肽缩合试剂以及氨基酸保护基，包括合成环肽的氨基酸正交保护上也取得了丰硕的成果。

2、技术革新---- Fmoc保护基的引入：1972年，路易斯·卡彭特（Louis Carpino）开发了Fmoc（9-芴甲氧羰基）保护策略。与Boc需强酸（如三氟乙酸，TFA）脱保护不同，Fmoc可通过温和的碱性条件（如哌啶）脱除，减少副反应，尤其适用于复杂多肽和自动化合成。自动化合成仪：1980年代，首台商业多肽合成仪问世，大幅提升了合成通量和精度。

3、成熟与扩展（1990年代至今）---- 树脂与试剂的优化：开发了高载量、亲水性的PEG修饰树脂（如Tentagel），以及高效偶联试剂（如HBTU、HATU）。应用拓展：从多肽延伸至寡核苷酸、多糖及小分子化合物合成。技术融合：微波辅助合成、流动化学等新方法进一步缩短反应时间并提高产率。

三、技术详解 1. 基本原理与步骤

固相载体：常用树脂包括聚苯乙烯（疏水性）和PEG接枝树脂（亲水性），功能基团如Wang树脂（羟基）、Rink酰胺树脂（氨基）决定产物C端结构。

保护策略：

Boc法：Boc保护氨基，需TFA脱保护；适合短肽，但长链易因强酸累积损伤。

Fmoc法：Fmoc保护氨基，哌啶脱保护；条件温和，兼容侧链多样化保护（如t-Bu、Trt基团）。

要成功合成具有特定的氨基酸顺序的多肽，需要对暂不参与形成酰胺键的氨基和羧基加以保护，同时对氨基酸侧链上的活性基因也要保护，反应完成后再将保护基因除去。同液相合成一样，固相合成中多采用烷氧羰基类型作为α氨基的保护基，因为这样不易发生消旋。最早是用苄氧羰基，由于它需要较强的酸解条件才能脱除，所以后来改为叔丁氧羰基（BOC）保护，用TFA（三氟乙酸）脱保护，但不适用含有色氨酸等对酸不稳定的肽类的合成。changMeienlofer和Atherton等人采用Carpino报道的Fmoc(9-芴甲氧羰基)作为α氨基保护基，Fmoc基对酸很稳定，但能用哌啶-CH2CL2或哌啶-DMF脱去，近年来，Fmoc合成法得到了广泛的应用。羧基通常用形成酯基的方法进行保护。甲酯和乙酯是逐步合成中保护羧基的常用方法，可通过皂化除去或转变为肼以便用于片断组合；叔丁酯在酸性条件下除去；苄酯常用催化氢化除去。对于合成含有半胱氨酸、组氨酸、精氨酸等带侧链功能基的氨基酸的肽来说，为了避免由于侧链功能团所带来的副反应，一般也需要用适当的保护基将侧链基团暂时保护起来。保护基的选择既要保证侧链基团不参与形成酰胺的反应，又要保证在肽合成过程中不受破坏，同时又要保证在最后肽链裂解时能被除去。如用三苯甲基保护半胱氨酸的S-，用酸或银盐、汞盐除去；组氨酸的咪唑环用2,2,2-三氟-1-苄氧羰基和2,2,2-三氟-1-叔丁氧羰基乙基保护，可通过催化氢化或冷的三氟乙酸脱去。精氨酸用金刚烷氧羰基（Adoc）保护，用冷的三氟乙酸脱去。

固相中的接肽反应原理与液相中的基本一致，将两个相应的氨基被保护的及羧基被保护的氨基酸放在溶液内并不形成肽键，要形成酰胺键，经常用的手段是将羧基活化，变成混合酸酐、活泼酯、酰氯或用强的失去剂（如碳二亚氨）形成对称酸酐等方法来形成酰胺键。其中选用DCC、HOBT或HOBT/DCC的对称酸酐法、活化酯法接肽应用最广。

裂解及合成肽链的纯化 BOC法用TFA+HF裂解和脱侧链保护基，FMOC法直接用TFA，有时根据条件不同，其它碱、光解、氟离子和氢解等脱保护方法也被采用。合成肽链进一步的精制、分离与纯化通常采用高效液相色谱、亲和层析、毛细管电泳等。

合成循环：

• 脱保护：移除氨基保护基（Fmoc用20%哌啶/DMF）。

• 偶联：活化羧酸的氨基酸（如用HBTU/HOBt/DIEA）与树脂上的游离氨基反应。

• 洗涤：DMF、DCM等溶剂去除未反应试剂。

切割与纯化：合成完成后，用TFA（含清除剂如H₂O、TIS）切割树脂与多肽间的连接键，经HPLC和质谱纯化鉴定。

2. 关键试剂与载体

偶联试剂：HBTU/HATU（提高偶联效率）、DIC/Oxyma（减少消旋化）。

树脂类型：

Wang树脂：适用于羧酸终产物（如游离酸或酯）。

Rink酰胺树脂：生成C端酰胺化多肽（类似天然蛋白结构）。

侧链保护基：如Trityl（Trt）保护半胱氨酸，Pbf保护精氨酸，防止副反应。

C端羧肽合成可选用Wang树脂；对于C端酰胺肽的合成，可选择Rink Amide AM Resin或Rink Amide MBHA Resin；对于全保护肽的合成，我们可以选择2-Cl Trt Resin。

树脂的参数及其含义：
一般树脂的参数包括载量、目数和规格，如1% DVB。
载量：单位为mmol/g，即每克树脂存在多少毫摩尔官能团。
目数：粒度一般为100-200目，数值越大，颗粒越细。
1% DVB：交联剂二乙烯基苯在苯乙烯和二乙烯基苯共聚物中的比例。

固相多肽合成广泛应用于药物开发领域，如合成胰岛素类似物、GLP-1受体激动剂（如利拉鲁肽），定制表位肽用于抗体生产或蛋白相互作用研究。固相合成技术正朝着高通量、绿色化学（减少溶剂浪费）和智能化（AI优化序列设计）方向发展。新型载体（如可降解树脂）和连续流反应器有望进一步突破合成极限，推动合成生物学与精准医疗的进步。

参考文献：

1. Merrifield, R.B. (1963). J. Am. Chem. Soc., 85(14), 2149–2154.

2. Chan, W.C., & White, P.D. (2000). Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach. Oxford University Press.

3. Henninot, A., et al. (2018). J. Med. Chem., 61(4), 1382–1414.

固相多肽合成中可能出现的问题：

1. 什么是净肽含量（肽含量），其意义是什么？
多肽的干重不仅包含肽本身，还包括水分、吸附溶剂、配位离子及盐类等非肽成分。净肽含量指肽在该混合物中的重量百分比，范围通常在50%-90%之间，具体取决于纯度、序列及合成/纯化方法。净肽含量不可与肽纯度混淆——二者概念不同：纯度通过高效液相色谱（HPLC）测定，表示正确序列组分的百分比；而净肽含量量化的是肽材料相对于非肽物质的比例。净肽含量通常通过氨基酸组成分析或紫外分光光度法测定，这对肽浓度敏感的实验至关重要。

2. 多肽生产的常用方法有哪些？
线性肽采用Fmoc固相法从C端向N端延伸合成。首个氨基酸通过酸敏连接剂固定于不溶性树脂上，经哌啶去除Fmoc保护基后，耦联第二个Fmoc保护氨基酸。活化方式包括预活化或“一锅法”。完成目标序列后，用三氟乙酸（TFA）将肽从树脂上切下，获得粗产物。

3. 如何根据实验选择肽纯度？

纯度需求依实验目的而定：

• 筛选实验（低灵敏度）：粗品＞75%

• 免疫实验：＞85%

• 受体-配体研究、生物测定或细胞实验：＞95%

• 结构研究：＞98%

4. 为何合成含Cys、Met或Trp的肽较困难？
这些残基易氧化，合成高纯度含此类残基的肽需特殊工艺，储存时需避免反复接触空气。

5. 若肽纯度为95%，剩余5%是什么？
主要为耦联步骤不完善产生的氨基酸缺失副产物，因其色谱性质相似，常与目标肽共同洗脱。

6. 未HPLC纯化的肽含哪些杂质？
粗品或脱盐肽可能含截短肽、残留溶剂（如DTT、TFA）及合成试剂。

7. 最佳肽长度是多少？
合成效率随长度增加（＞20残基）下降。短肽（5残基）建议使用疏水性氨基酸以简化纯化；功能域两侧建议添加亲水/带电残基提升溶解性。

8. 如何从序列预测肽溶解性？

• 疏水残基（Leu、Val、Ile、Met、Phe、Trp）＞50%：可能难溶于水

• 带电残基（Lys、Arg、His、Asp、Glu）≥20%：溶解性佳

• 中性肽：需有机溶剂（如DMSO、乙腈）

9. 如何纯化多肽？采用反相HPLC（C8/C18柱），以TFA/乙腈梯度洗脱。疏水肽可能需甲酸或乙酸。长肽（＞20aa）需质谱鉴定目标峰。

10. 如何计算Fmoc-氨基酸树脂载量？
两种方法：
(1) 耦联后增重除以分子量与树脂质量
(2) 紫外吸光度分析：如果肽段序列中含有Trp或Tyr，可用紫外法分析肽段的含量，根据摩尔消光系数：
色氨酸 5,560 AU/mmole/ml
酪氨酸 1,200 AU/mmole/ml
（280 nm at 中性pH使用 1 cm 比色皿）
肽的摩尔消光系数可以根据每个色氨酸或酪氨酸的系数相加，然后根据在 280 nm 处测得的吸光值按公式计算。
mg 肽/ml = (A280 x DF x MW) / e
A280，280 nm 处的实际吸收值（1 cm 池），
DF，稀释因子，
MW，肽的分子量
e，肽的摩尔消光系数

11. 如何溶解多肽？

• 净电荷＞0（碱性）：溶于水；可加乙酸（≥10%）或TFA

• 净电荷=0（酸性）：溶于水；可加氨水

• 中性电荷：用有机溶剂（如DMSO、乙腈）或尿素

12. 如何储存合成肽？

• 长期：冻干、干燥后-20°C保存

• 含Cys/Met/Trp的肽：用脱氧缓冲液；避免反复冻融

• 含Gln/Asn的肽：因易降解，保质期有限

13. 如何处理肽末端？

肽用于模拟蛋白质。为了模拟蛋白质的表达，我们需要合成与蛋白质具有相似结构和电荷的肽。当一个肽从蛋白质中“切出”时，两端的电荷数将与基因体蛋白的电荷数不同。我们需要改变合成策略以使它们保持一致。一般来说，如果来自蛋白质的C端，N端被乙酰化屏蔽；如果它来自蛋白质的N端，则C端被酰胺化屏蔽；如果它来自蛋白质的中间部分，则两端被乙酰化和酰胺化屏蔽。

编辑自：

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2、百度百科：https://baike.baidu.com/item/%E5%A4%9A%E8%82%BD%E5%9B%BA%E7%9B%B8%E5%90%88%E6%88%90%E6%B3%95/7327635