双载荷抗体偶联药物研发进展和药学审评考虑

摘要

抗体偶联药物(antibody-drug conjugate, ADC)是将小分子药物(payload)通过化学连接子(linker)偶联到单克隆抗体上形成的靶向药物。近年来, ADC研发蓬勃发展, 全球已有10余款ADC获批上市。随着技术进步, 新一代ADC呈现出更加复杂的设计趋势, 如在同一抗体分子上偶联2种不同的载荷(即双载荷ADC)。双载荷ADC有望通过一次给药同时递送2种有效载荷, 增强对异质性肿瘤的杀伤并克服耐药。然而, 这类ADC因结构复杂、均一性/杂质控制难度高, 给药学研究与监管审评带来新的挑战。本文探讨双载荷ADC研发进展和药学审评关注点, 包括生产用原材料、生产工艺、结构表征与杂质研究、分析方法、质量控制和稳定性研究等方面, 结合实际申报中发现的药学研究缺陷, 探讨双载荷ADC产品的研发进展和药学审评考虑, 旨在为该类产品的开发和药学研究提供实用参考。

正文

抗体偶联药物(antibody-drug conjugate, ADC)是将单克隆抗体的高度靶向性与小分子细胞毒素的强效杀伤作用相结合, 从而实现对肿瘤细胞的定向消除。自2000年首款ADC药物获批以来, 随着技术的不断发展和累积, 从2020年开始ADC领域呈现爆发式增长趋势, 新一代ADC在连接子稳定性、药效和安全性上均有显著改进。目前全球已有超过15款ADC上市, 用于乳腺癌、淋巴瘤等多种肿瘤的治疗。在我国, ADC研发亦方兴未艾, 已有多款本土研发的ADC获得上市许可, 进入临床研究阶段的ADC数量也呈稳定增长趋势。从分子结构上看, 除传统的单一载荷ADC外, 还包括在同一抗体分子上偶联2种不同的载荷(即双载荷ADC)。相较于单一载荷ADC, 双载荷ADC在药效方面存在一定潜在优势, 例如: 研究显示将2种不同作用机制的细胞毒性药物结合于同一ADC, 可同时作用于肿瘤细胞, 从而克服单一药物可能引发的耐药并提高疗效。还有研究尝试在ADC上同时偶联细胞毒性药物和免疫激活剂, 实现“化疗+免疫”双重打击, 这类“双弹头”ADC有望在对抗肿瘤耐药和异质性方面通过其特有的多种小分子间协同或正交作用发挥独特优势。此外, 对于同样含有2种以上小分子的其他治疗策略, 如联合化疗、单一载荷ADC联合化疗、2种单一载荷ADC联合等, 其将在相对一致的时间和空间上发挥各自功能, 肿瘤细胞摄入2种载荷的比例相对可控, 以上特点可能对药物的临床安全性、有效性产生积极影响。但与此同时, 双载荷ADC复杂的结构异质性也对药物的上游构建、生产工艺、质量表征与控制等研究提出了更高要求。

目前, 全球双载荷ADC研发仍处于起步阶段, 尚无上市产品, 但若干候选药物已进入临床研究。截至2025年5月, 我国监管机构已批准2款双载荷ADC的新药临床试验申请(investigational new drug, IND), 这也是全球最早获准开展人体临床试验的2款药物。为更好地指导研发, 国家药品监督管理局药品审评中心于2024年发布了《抗体偶联药物药学研究与评价技术指导原则》(以下简称“指导原则”), 对ADC的药学研究提出了相关要求, 其中对双载荷ADC的偶联工艺、过程控制、载药分布和电荷异构性表征等方面进行了明确。由于双载荷ADC的药学开发及相关研究与单载荷ADC有部分重叠, 本文仅对双载荷ADC特有的药学研究考虑进行详细讨论, 包括生产用原材料、结构表征、分析方法、杂质研究、稳定性研究、关键质量属性控制等, 相同部分不再赘述, 以期为该类药物的研发提供帮助。

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生产用原材料(裸抗及小分子)

2种载荷的选择是双载荷ADC作用机制的重要基础和设计重点。目前, ADC产品主要应用的载荷种类见表1。

双载荷ADC的载荷选择可采用正交策略(如递送2种不同机制的载荷)或协同策略(如A药物可增强B药物的抗肿瘤活性)。对于正交策略, 载药组合设计为RNA聚合酶抑制剂+拓扑异构酶抑制剂, 在DNA/RNA水平以2种互补的肿瘤杀伤机制克服肿瘤内细胞的异质性和耐药性。此外, 也可选择微管蛋白抑制剂+TLR激动剂, 形成“化疗+免疫”一体化的靶向药物, 迅速减少肿瘤负荷, 并重编程肿瘤微环境, 招募和激活免疫细胞攻击残余肿瘤细胞。对于协同策略, 载药组合一般设计为在同一作用通路上的2种载荷, 包括拓扑异构酶抑制剂+DNA损伤应答抑制剂(如PARP抑制剂), 2种载荷均靶向肿瘤细胞的DNA损伤修复机制, 在同一通路的不同节点发挥作用, 有助于增强肿瘤细胞对拓扑异构酶抑制剂的敏感性。

连接子方面, 除分枝连接子外, 其他与单载荷ADC基本一致, 可分为可裂解连接子和不可裂解连接子。双载荷ADC的2种载荷可能在不同的细胞定位(细胞内/微环境)或不同释放条件下发挥作用, 但却依赖于同一个抗体分子所带来的“制导作用”, 因此建议研发者从整体分子的结构和作用机制综合考虑, 评估不同载荷对应连接子的设计对ADC分子的疏水性、空间结构、载荷释放时间及空间等属性的影响, 确保双载荷ADC发挥预期的作用机制。

裸抗方面, 由于双载荷ADC生产中一般需要进行2种正交的偶联方式, 因此对裸抗进行工程化改造引入额外的偶联位点在该类产品中较为常见。涉及裸抗改构的偶联方式主要包括: 工程化半胱氨酸偶联、非天然氨基酸偶联、酶介导偶联等。建议研发者在申报资料中详细提供裸抗的改构信息, 并在适当节点对改构结果进行表征。例如: 涉及引入或替换氨基酸的, 建议在载体构建、细胞库表征、代表性裸抗批次的结构确证等节点, 采用测序、肽图等方法在核苷酸/氨基酸水平上对改构进行确证性研究。此外, 对于仅在一条轻/重链上引入氨基酸突变用于偶联的产品(如对于该载荷中ADC单分子的半边载药另外半边不载药), 尽管未突变链在后续工艺中不会偶联对应载荷, 而是在载药分布表征中归为该载荷的DAR0杂质, 但考虑到载药分布表征前可能对样品进行还原等预处理, 因此难以代表正常条件下ADC的完整结构, 仍不能表征二硫键错配杂质的含量(即使该类设计一般采用knob-into-hole结构)。审评建议在裸抗放行阶段对二硫键错配杂质进行控制, 将有助于增强下游ADC产物的均质性; 涉及糖基化修饰改构的, 如酶介导的糖链修剪、叠氮化反应添加偶联基团等, 建议在改构操作前后设置过程控制节点, 对中间产品的N寡糖谱进行监测, 关注改构操作的稳健性和待偶联样品的批间一致性。

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生产工艺

双载荷ADC产品生产工艺的主要特点为一般涉及2种偶联方式。目前, 双载荷ADC的偶联策略主要分为以下2类: 基于小分子的分支连接子策略和基于氨基酸的正交偶联策略。基于小分子的分支连接子策略采用具有多个分支的连接子, 将多个药物分子通过相同偶联位点连接到抗体上, 从而提高载药率(drug-antibody ratio, DAR)。该方法又可细分为2类。①三臂或多臂连接子的其中一条主链与抗体结合, 其他分支通过多步偶联工艺进行多种载荷载药。例如: SEACEN公司设计了一种含有2种不同保护基团的半胱氨酸偶联位点的分支连接子, 其分别在三(2-羧乙基)膦[tris(2-carboxyethyl) phosphine, TCEP]或乙酸汞处理下进行脱保护, 在抗体的链间二硫键中对分支连接子进行常规的半胱氨酸偶联后, 再进行两步脱保护-偶联反应以分别偶联2种不同的载荷, 最终形成DAR值为16(8+8)的双载荷ADC; ②分支载药单元, 即在连接子合成阶段直接负载多种小分子药物。例如: 瑞士Araris Biotech AC公司通过微生物转谷氨酰胺酶(microbial trans-glutaminase, mTC)将双载荷-连接子一步偶联至抗体Fc段的Q295位点, 最终获得DAR值为4(2+2)的双载荷ADC。该策略可实现单步双载荷偶联, 提高生产效率, 然而使用此策略的挑战在于每个载荷组合的分支连接子都需要重新设计合成, 因此开发成本较高且灵活性受限。综上所述, 分支连接子策略本质上是双载荷同偶联位点(对抗体分子而言, 两载荷预期偶联至相同位点)技术, 其主要对小分子部分进行设计和改构, 需要注意分枝结构往往增大ADC的疏水性, 必要时可以考虑在连接子中引入疏水屏蔽基团或亲水链(如PEC)平衡整体水溶性, 以规避潜在的分子聚集和非特异性吸附等质量风险。

基于氨基酸的正交偶联策略通过2种正交的偶联方法, 即在抗体分子的不同位点分别偶联2种载荷。目前, 主流的基于氨基酸的偶联方法如下: 链间半胱氨酸偶联、工程化半胱氨酸偶联、工程化非天然氨基酸偶联、酶催化偶联(如微生物转谷氨酰胺酶介导的Q295位点定点偶联、半乳糖转移酶催化叠氮化反应介导的糖链偶联)等。除链间/工程化半胱氨酸偶联在偶联机制上基本一致(但仍可通过关键工艺参数优化完成双载荷分步偶联)外, 以上主要使用的偶联方法均具有一定特异性, 方法间相互影响较小, 为分步偶联不同载荷提供了理论基础。

工艺开发方面, 双载荷ADC复杂的生产工艺需要进行更加深入和细致的工艺开发研究。工艺开发须综合优化2种偶联反应的条件, 确保均能达到目标偶联率, 对工艺参数研究提出了更深入的要求, 如不同还原度对每种载荷偶联的影响、2种载荷偶联先后顺序的考量等。此外, 由于2种偶联反应一般是正交的, 在工艺放大过程中2种偶联工艺的效率、杂质残留等可能呈现出非线性、不完全协调的变化趋势, 这意味着工艺放大研究不仅需要考虑偶联工艺内的工艺性能波动, 还应综合考虑偶联工艺间的放大协调性。建议研发者基于“质量源于设计”的理念, 综合考虑2种载荷的载药分布、偶联及偶联前处理对产品整体分子的影响、偶联产生的产品/工艺相关杂质及所需清除能力、不同偶联方式间的相互影响等因素, 合理选择偶联方式、偶联顺序和后续纯化步骤, 开展工艺开发研究。

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质量研究和控制

3.1 特性鉴定

3.1.1 DAR值和载药分布

双载荷ADC存在多种载药组合(a+b)形式, 其整体物质组成中不仅包括总DAR值不同的ADC分子, 即使在总DAR值相同的分子中还包括2种载荷不同比例的载药组合, 应对不同载荷的偶联特性进行分别表征与控制。单载荷ADC的产品经验显示, 载药数量及分布是影响产品安全性和有效性的关键质量属性, 进而可以预期双载荷ADC中任一载荷平均载药数量或不同载药组合比例的波动都可能直接影响产品的疗效和安全性。因此, 基于偶联方式、偶联位点、载荷间理化性质差异等因素, 选择适当的分析方法对DAR值和载药分布进行研究, 对于评估双载荷ADC产品的结构均一性、批间质量一致性具有重要意义。

对于双载荷ADC的载药特性表征, 适当的分析方法应充分利用2种载荷间的理化性质差异以区分不同载荷的载药情况。目前, 应用于单载荷ADC的DAR值检测分析方法主要有疏水作用色谱(hydrophobic interaction chromatography-high performance liquid chromatography, HIC-HPLC)、反相色谱(reversed-phase high performance liquid chromatography, RP-HPLC)、液相色谱-质谱联用(liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS)、紫外-可见分光光度法(ultraviolet-visible spectrophotometry, UV/Vis)和毛细管凝胶电泳(capillary gel electrophoresis with sodium dodecyl sulfate, CE-SDS)等。其中, UV/Vis法和CE-SDS法的检测原理分别为通过检测小分子的吸光度和相对分子质量对载荷的载药情况进行半定量分析。但对于同时检测2种载荷, 载荷间的吸收光谱和相对分子质量差异可能不足以在分析方法的灵敏度内有效区分2种载荷, 即方法的专属性不能支持分别报告2种载荷的载药量, 目前申报的双载荷ADC产品中也未见以此2种分析方法表征DAR值。HIC-HPLC法和RP-HPLC法均为基于疏水性差异以分离不同载药量ADC分子的分析方法, 但由于2种方法在填料疏水性、样品处理条件等方面的差异, 对于载药特性的表征各有侧重。HIC-HPLC法在非变性条件下进行检测, 可在基本保留产品完整结构的情况下分析其载药特征, 其局限在于分离分辨率相对较低, 疏水性差异小的峰容易重叠, 在双载荷ADC的分析中更容易被放大, 载荷间固有的疏水性差异叠加复杂的载药数量组合是否足以在该方法中表现出足够的峰分离度, 可能需要检测参数的持续优化并要求具体案例具体分析。RP-HPLC法是目前双载荷ADC产品申报中较为常见的载药特性分析方法, 该方法可将复杂的载药组合通过还原处理在单链水平上进行载药分析, 其含有三氟乙酸的流动相, 可以增强峰分离度。需要注意的是, 该方法中较强的还原条件可能造成载荷脱落, 导致DAR值略低于真实值。在双载荷ADC中还应考虑2种连接子-载荷对还原条件的敏感性是否一致, 尽可能优化处理条件以准确反映样品载药情况。虽然有报道表明优化后的RP-HPLC方法可在无须样品预处理(还原)的情况下进行载药分布检测, 但方法尚不成熟且暂未见业界应用, 常规RP-HPLC方法的主要局限仍为无法直接在整体ADC分子水平上对载药分布进行表征, 需要其他方法进行互补分析。LC-MS法为基于相对分子质量的分析方法, 对ADC分子进行Lys-C等酶降解后, 通过分析肽段的一级质谱和二级碎片离子信息, 对偶联位点进行确证, 并根据偶联/未偶联肽段的色谱峰面积比例计算单个偶联位点占有率。该方法的精度和灵敏度较高, 其肽段水平的分析一般情况下可以在一定程度上规避2种载荷在整体分析中难以有效区分的问题, 同时可以通过有无异常峰型相对准确地判断非预期偶联(如单载荷非预期位点偶联、双载荷交叉偶联等)的发生。同样, 高精度伴随对整体结构反映的不足, 在实际应用中, 可以考虑与RP-HPLC联用, 基于相对分子质量和疏水性对双载荷ADC产品的载药情况进行正交表征。此外, 如指导原则所述, 可采用酶解、还原等方式分段降低ADC分子结构的复杂性, 该策略在双载荷ADC产品中应用频次更高, 建议申请人根据产品特点选择合理的预处理方式以完善载药特性表征。

3.1.2 生物学活性

目前, ADC产品的基于作用机制的细胞水平生物学活性检测一般采用ADC与表面表达靶抗原的靶细胞共孵育的体外细胞增殖抑制实验。双载荷ADC的生物学活性分析方法及控制策略与单载荷ADC基本一致, 但建议关注并表征其相较于单载荷ADC的额外作用机制: 是否在特定模型中表现出协同增效或扩大的细胞杀伤能力。例如, 可分别制备仅偶联药物a或仅偶联药物b的ADC, 与双载荷ADC平行进行细胞毒性比较。如果双载荷设计具有协同作用, 应当体现在双载荷ADC对某些细胞的杀伤强于任一单载荷ADC; 如果双载荷设计具有正交作用, 则能够杀伤单载荷ADC无效的耐药靶细胞。实验时也可考察不同靶抗原表达水平或不同耐药状态的细胞株对双载荷ADC是否表现出差异化的敏感性, 以验证其克服耐药及增强抗肿瘤活性的预期机制与潜在优势。对于载有免疫激动剂的双载荷ADC, 除表征其细胞毒性作用直接杀伤肿瘤细胞的活性外, 应同时开发针对产品免疫激动功能的体外分析方法, 例如: 根据激动剂种类(TLR/STINC激动剂), 构建对应分子通路的细胞水平荧光报告基因系统。

3.2 杂质研究

交叉载药杂质: 在双载荷ADC的偶联反应中, 可能形成一些非预期的交叉杂质。此类杂质包括交叉偶联产物(本应连接药物a的位点误偶联了药物b或反之导致特定位点的杂合偶联)、载荷交联物(例如: 在分支连接子策略中, 2种药物未能分别连接在不同分支上, 而是发生了载荷间交联或自偶联副反应)等。交叉载药杂质的产生往往与偶联工艺间的原理有部分交叉或与偶联副反应有关, 如果2种载荷的偶联机制不完全正交, 则可能发生彼此竞争同一位点或互相反应的情况。这些杂质通常在结构上与预期载药形式高度相似, 但功能活性可能不同, 建议通过高灵敏度的分析方法(质谱、肽图等)加以鉴别和量化, 并通过工艺优化将其含量控制在可接受范围内。

偶联不完全或未偶联杂质: 在双载荷ADC制备过程中, 可能出现部分抗体分子未偶联上2种载荷或其中之一的情况, 导致在最终产品中存在未偶联的裸抗体(DAR=0)或只偶联了1种药物的“单载荷ADC”杂质。例如: 采用不同位点分别偶联载荷a和b的策略中, 如果某批次反应中药物b偶联效率波动至较低水平, 则会残留某些仅带有药物a的ADC分子。该类不对称未偶联杂质不能发挥预期的双载荷间的协同或正交活性作用, 因此, 将对整体样品的有效性造成稀释作用, 同时由于其偶联载荷数量少、疏水性较低, 可能表现出与主要载药形式不同的药动学特征。建议在载药特性的表征中对该类杂质予以关注, 结合工艺稳健性并基于风险合理拟定该类杂质的控制策略, 如分别报告2种载荷的DAR0含量。

除上述杂质外, 双载荷ADC还面临与单载荷ADC相似的杂质和变异体问题。例如: 由于高疏水性载药导致的聚集体增加, 偶联过程可能引入小分子副产物、偶联方法特异性杂质(如糖偶联工艺中可能引入的糖链修剪、酶转移链接、点击反应等步骤反应不完全所产生的杂质)、电荷异构体变化等。另外, 工艺相关杂质的种类或残留水平也可能因多种偶联方法而增加, 建议研发者规范开展各类工艺相关杂质残留的安全因子范围分析, 如涉及暂无毒理学数据的杂质(自制酶等), 应根据非临床批次残留量并结合分析方法和工艺的变异度综合拟定其控制限度并纳入质量标准。总体而言, 双载荷ADC杂质的复杂性主要来源于该类产品生产中多种偶联方法的使用以及两载荷间复杂的载药分布组合。建议根据产品结构和所用偶联工艺的特点, 结合高灵敏度且正交的分析方法, 充分评估并表征双载荷ADC的杂质, 为有效制定质量控制策略提供基础。

3.3 质量标准

检验项目方面, 除ADC常规检项外, 建议将与2种载荷有关的质量属性分别纳入质量标准中进行控制。例如: DAR值(DAR-a和DAR-b)、载药分布(各a+b构型比例)、未偶联抗体(未偶联载荷a/b含量)、游离小分子含量(载荷a/b及有关物质含量)等。此外, 应根据杂质研究结果, 评估非预期偶联杂质、偶联工艺特异性杂质等对产品临床安全性和有效性的影响, 必要时纳入质量标准。标准限度的拟定策略和依据与单载荷ADC基本一致。

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稳定性研究

相较于单载荷ADC(只需要监控1种药物的脱落), 双载荷ADC需要同时关注2种不同药物的潜在脱落。2种载荷的连接子可能对储存条件(如温度、光照强度、pH等)的敏感性不同, 进而在稳定性研究中出现选择性脱落其中1种载荷的趋势, 从而逐渐改变产品内载药组合比例, 同时释放游离的小分子药物。因此, 在双载荷ADC产品开发和临床试验过程中, 应在稳定性研究中对2种载荷的脱落情况分别进行监测, 根据游离小分子的波动趋势, 合理优化产品处方和储存条件, 确保效期内整体载药分布和游离小分子水平的波动处于可接受范围内。

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总结与展望

随着载荷/连接子种类的不断丰富和偶联技术的持续发展, 双载荷ADC作为一种新兴的分子设计策略, 展现出多靶点联合打击、协同增强疗效及克服肿瘤异质性和耐药性的潜在优势, 已成为下一代ADC产品的重要发展方向。然而, 这一设计所带来的结构/工艺复杂性也对药物的研发和技术审评提出了挑战。本文结合目前双载荷ADC的研发进展, 对该类产品的生产用原材料、生产工艺和质量研究等方面的药学审评考虑进行阐述, 以期为该类产品的研发和申报提供参考。随着偶联策略和分析方法的不断优化和改进, 更多双载荷ADC产品进入申报阶段, 对该类产品的理解将逐渐深入, 监管机构也将继续推进指导原则的更新与完善, 双载荷ADC有望为肿瘤治疗带来新的突破。

参考文献

详见《中国新药杂志》 2025年 第34卷第24期

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