ADC中的酶可切割肽连接子

引言

抗体偶联药物（ADC）作为一种强大的癌症治疗模式，其成功在很大程度上归功于连接子系统的发展，该系统能够在癌细胞内实现细胞毒性载荷药物的靶向释放。许多溶酶体蛋白酶在人类癌症中过度表达，能有效切割多种肽序列，这一特性被用于ADC连接子系统的设计。其中，缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄基氨基甲酸酯连接子已在许多获批或处于临床前和临床开发阶段的ADC中使用。

尽管ValCit-PABC及其相关连接子在溶酶体中容易被组织蛋白酶切割，同时在人类血浆中保持相当稳定，但许多研究表明它们易受小鼠和大鼠血浆中的羧酸酯酶1C的影响，这阻碍了ADC的临床前评估。此外，ADC最常见的剂量限制性不良反应——中性粒细胞减少症和血小板减少症，被认为是由人中性粒细胞弹性蛋白酶对ValCit-PABC的过早水解引起的。除了ValCitPABC，GGFG四肽-氨基甲氧基连接子也是组织蛋白酶可切割的，并已用于ADC药物DS8201a中。除了组织蛋白酶可切割的连接子，豆荚蛋白敏感连接子也日益受到ADC开发的关注。提高血浆稳定性同时保持ADC连接子的溶酶体可切割性是当前深入研究的重点。

一、ADC的作用机制与连接子设计原理

ADC的作用机制涉及抗体与癌细胞上特定抗原的结合，随后通过受体介导的内吞作用内化。一旦进入癌细胞，抗体在核内体-溶酶体区室中的降解和/或连接子的切割将释放药物载荷，随后其在细胞质或细胞核中发挥其杀细胞作用。研究人员利用了两个重要的核内体-溶酶体特征来设计药物释放的连接子系统：(i) 溶酶体内部的酸性环境用于设计酸不稳定性连接子，以及 (ii) 特定溶酶体蛋白酶的过度表达用于设计蛋白酶可切割的连接子。在17种获批的ADC中，有9种的连接子中含有蛋白酶可识别的肽序列。连接子-载荷优化是ADC开发中最关键的任务之一。

溶酶体蛋白酶可切割的ValCit-PABC连接子系统在许多已获批的ADC中使用，其在连接Cit和PABC的酰胺键处容易被切割，导致自消除性载荷释放。最初认为只有组织蛋白酶B负责切割ValCit-PABC；然而，后来的基因敲除研究表明，其他组织蛋白酶，如组织蛋白酶S、L和F，也参与了切割机制。研究还揭示了多种二肽序列可以作为这些溶酶体酶的底物。在ValCitPABC连接子的初步开发之后，研究人员已经测试了大量的肽/拟肽序列，以进一步改进连接子系统。

ValCit-PABC连接子系统已被证明在人类血清中具有良好的稳定性，这是ADC在体循环中维持酶降解的最重要标准。然而，许多研究表明ValCit-PABC在小鼠血浆中不稳定，这种降解是由一种称为羧酸酯酶C1的蛋白酶引起的。这种不稳定性阻碍了ADC的临床前评估。此外，ADC治疗通常会导致癌症患者中性粒细胞减少。Zhao等人使用纯化的中性粒细胞弹性蛋白酶评估了具有可切割缬氨酸-瓜氨酸连接子或不可切割马来酰亚胺己酰连接子的ADC的体外稳定性，结果表明ValCit连接子容易被弹性蛋白酶切割以释放游离MMAE，而MC连接子则不能。

二ValCit-PABC连接子的优化策略与结构-活性关系

1. 在P3位添加极性酸性残基以增加血浆稳定性

ValCit-PABC连接子被设计为由组织蛋白酶B在连接P1残基瓜氨酸和P1' PABC的酰胺键处切割。组织蛋白酶B是一种主要存在于溶酶体中的半胱氨酸蛋白酶。然而，研究表明ValCit-PABC可以被小鼠血浆中的Ces1C切割。在明确Ces1C介导的切割机制后，作者合成了几种在P3位具有取代的新型连接子-载荷分子并测试了其稳定性。有趣的是，他们观察到当某些亲水基团被引入P3位时，小鼠血浆稳定性增加；特别是，2-羟基乙酰胺基团极大地提高了血浆稳定性。

受这些结果的启发，Anami等人在P3位引入了亲水性氨基酸，发现虽然SerValCit在稳定性上改善甚微，但在P3位具有酸性氨基酸的连接子，如GluValCit和AspValCit，在小鼠血浆中表现出优异的稳定性。相反，在P3位具有碱性氨基酸Lys使LysValCit连接子比母体ValCit连接子更不稳定。这表明P3位的酸性氨基酸有效地阻断了Ces1C的接近，而碱性氨基酸增强了Ces1C与连接子之间的相互作用。重要的是，上述讨论的所有连接子-载荷设计在人类血清中都非常稳定，并且它们仍然对溶酶体酶组织蛋白酶B敏感，这对于癌细胞内的药物释放至关重要。

2. P1位极性碱性残基取代改善溶酶体切割活性

研究人员设计了大量的P2-P1二肽，通过取代P2-Val和P1-Cit，旨在增加连接子的溶酶体可切割性并改善其在小鼠血浆中的稳定性。当极性瓜氨酸被丙氨酸取代时，血浆稳定性进一步下降，尽管组织蛋白酶B的载荷释放未受影响。当极性带负电荷的天冬氨酸被引入P1位时，血浆稳定性没有显著变化；然而，它显示出组织蛋白酶B的载荷释放减少。相反，另一项关于P1氨基酸对组织蛋白酶介导切割影响的研究表明，P1位的精氨酸残基将切割效率提高了九倍。这些结果表明，极性或碱性的P1氨基酸对于有效的载荷释放是可取的，而酸性残基则会降低切割效率。

3. PABC苯环上取代的影响

直接将Val-Cit连接到载荷上会导致由于载荷的位阻因素抑制组织蛋白酶与ValCit二肽的结合，从而导致较低的载荷释放效率。当在载荷和ValCit之间添加间隔基时，这个问题得到部分解决。PABC不仅改善了组织蛋白酶的结合，而且还经历自消除性1,6-消除以未修饰的形式释放载荷。目前，PABC与各种载荷和肽连接子系统一起使用。

为了改善ValCit-PABC连接子系统对小鼠血浆中Ces1C的稳定性，Podule等人合成了几种具有PABC上取代或替换的uncialamycin-连接子偶联物，包括用噻唑等杂环替换。在PABC苯环的间位引入N-甲基羧酰胺基团时获得了令人鼓舞的结果。所得的MA-PABC在小鼠血清中仅被切割3%，且其组织蛋白酶介导的释放未受影响。当在相同的MA-PABC的P3位添加谷氨酸时，小鼠血清中的切割在24小时内进一步减少至7%。添加谷氨酸不仅改善了对Ces1C的稳定性，还改善了溶解度，这在疏水性载荷使用时尤为重要。作者进一步通过用2-氨基乙基及其氨基聚乙二醇化形式替换甲基来增加连接子的亲水性。这些新的修饰为连接子提供了优异的小鼠和人类血清稳定性，且不影响组织蛋白酶B介导的切割。上述研究清楚地表明，结合结构-活性关系研究中的各种属性可以产生具有高血浆稳定性同时保持组织蛋白酶敏感性的理想连接子-载荷系统。

4. 串联可切割连接子

ValCit-PABC偶联ADC的一个常见缺点是骨髓抑制，这很可能是由连接子的过早切割和载荷释放引起的。为了改善ValCit-PABC-MMAE偶联ADC的体内稳定性，Chuprakov等人开发了一种有趣的串联可切割连接子。他们在PABC上引入了一个β-葡萄糖醛酸苷部分，作为位阻阻断剂，以保护ValCit-PABC连接子免受循环中丝氨酸蛋白酶的影响。内化后，β-葡萄糖醛酸糖苷酶介导的β-葡萄糖醛酸苷切割将首先暴露ValCit-PABC，然后其再被组织蛋白酶切割以在癌细胞内部释放MMAE。

所有ADC在体外针对B细胞非霍金淋巴瘤衍生的CD79b+ JeKo-1细胞进行测试时均表现出同等效力。正如预期，传统的ValCitPABC-MMAE ADC在大鼠血浆中于37°C孵育一周后损失了20%的载荷，而具有串联可切割连接子的ADC未观察到载荷损失。当在携带Granta 519异种移植物的小鼠中进行测试时，使用半胱氨酸偶联的MC-ValCit-PABC-MMAE与P1' PABC上具有β-葡萄糖醛酸苷部分的ADC在减少肿瘤体积方面表现出几乎同等的效力。

临床化学和血液学在第5天和第7天进行评估。研究了骨髓抑制的关键指标，即单核细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的水平。用传统的单切割连接子ADC治疗的大鼠的循环单核细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞水平显著降低，而用串联切割连接子ADC治疗的大鼠未显示任何骨髓抑制证据。事实上，后一组循环单核细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的水平与媒介物对照组相似，这清楚地表明在P1'位用β-葡萄糖醛酸苷部分掩蔽极大地增加了连接子在循环中的稳定性。

除了血浆不稳定性，二肽基连接子通常具有疏水性，可能导致ADC聚集。为了应对这些问题，Bargh等人报道了一种双酶可切割的3-O-磺基-β-半乳糖连接子，可以通过芳基硫酸酯酶A和β-半乳糖苷酶的连续作用以级联反应切割。ARSA/β-半乳糖苷酶组合极大地改善了溶酶体选择性切割。此外，阴离子硫酸基团和半乳糖部分的存在极大地改善了连接子在水介质中的溶解度。3-O-磺基-β-半乳糖连接子系统可用于生成具有高度疏水性载荷的ADC，这些载荷在水介质中容易聚集。

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三、GGFG四肽与豆荚蛋白敏感连接子

1. GGFG四肽-氨基甲氧基连接子

除了流行的肽-PABC系统，另一种肽连接子，包含用于自消除性药物释放的氨基甲氧基，已成功用于DS8201的开发。1995年，Nogusa等人通过将其氨基基团连接到羧甲基支链淀粉上制备了阿霉素的偶联物。他们证明，当在药物和多糖聚合物之间放置四肽间隔GGFG时，溶酶体酶有效地释放了游离阿霉素。当肽间隔是GFGG时，阿霉素仍可被释放，但程度远低于GGFG间隔。没有肽间隔的偶联物没有检测到药物释放。他们还表明，偶联物的抗肿瘤活性与连接子的可切割性平行，GGFG偶联物活性最高，无间隔基偶联物活性最低。

在2007年发表的一项研究中，Shiose等人报道了DX8951的大分子前药，其中聚合物载体羧甲基葡聚糖多元醇通过GGFG四肽间隔基在其氨基基团上与依沙替康偶联。研究发现，来自溶酶体的组织蛋白酶B、H和L能够切割甘氨酰-依沙替康酰胺键以释放游离依沙替康。在此基础上，Ogitani等人开发了一种靶向Her-2的ADC，即DS8201a，以DXd作为载荷。

DS8201a使用半胱氨酸-马来酰亚胺化学制备，理论DAR为8。DXd中的羟基被用于通过马来酰亚胺官能化的GGFG-氨基甲氧基连接子进行抗体偶联。ADC内化后，组织蛋白酶切割GGFG的C端甘氨酸与氨基甲氧基之间的酰胺键，触发后者分解以释放游离DXd。DS8201a在小鼠、大鼠或人类血浆中表现出良好的稳定性，在21天内仅释放1-2%的载荷。在后续研究中，Ogitani等人发现DS8201a表现出优异的旁观者效应，因为依沙替康中的游离胺被羟基乙酰基封闭，DXd载荷不能被质子化电离，因此具有高膜渗透性。DS8201a还被发现是一种非常有效的ADC，针对Her-2低表达的癌症，这主要归因于其高DAR为8以及DXd通过细胞膜扩散并杀死附近癌细胞的旁观者效应。

2. 豆荚蛋白敏感连接子

豆荚蛋白敏感连接子是一类利用豆荚蛋白酶特异性切割的肽序列，将抗体与细胞毒性药物连接起来的ADC连接子设计。豆荚蛋白是一种在癌细胞中高表达、并在肿瘤侵袭和转移中起关键作用的天冬酰胺内肽酶，主要存在于溶酶体中。其过度表达的特性使其成为设计蛋白酶可切割连接子的有吸引力的靶点。

在设计上，这类连接子通常包含能被豆荚蛋白特异性识别的肽序列（例如含有天冬酰胺的序列），并在其基础上结合自消除间隔基（如PABC），以实现细胞内的高效药物释放。研究已证实，含有AlaAlaAsn等序列的连接子可被豆荚蛋白有效切割，从而作为前药释放活性载荷。通过高通量筛选等方法，研究人员还发现了其他Asn相关的二肽序列（如AsnAsn、AsnAla等）对豆荚蛋白具有选择性，并且在小鼠血浆中表现出良好的稳定性。与传统的组织蛋白酶可切割连接子相比，豆荚蛋白敏感连接子旨在提供另一种具有潜在更高肿瘤选择性的裂解机制。

当前，这类连接子正受到ADC开发领域日益增长的关注，是连接子技术多样化发展的重要方向之一。

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结语

溶酶体可切割肽连接子是ADC技术发展的核心组成部分，其设计优化直接关系到药物的疗效、安全性与治疗窗口。从经典的ValCitPABC到新兴的串联可切割连接子、GGFG四肽系统以及对豆荚蛋白敏感连接子的探索，该领域的研究始终围绕着提高血浆稳定性与增强溶酶体特异性切割效率这两个核心目标展开。通过理性设计，如在P3位引入酸性氨基酸、优化P1位残基、对PABC苯环进行亲水性修饰等策略，已经显著改善了连接子的性能。未来，随着对溶酶体蛋白酶生物学理解的加深以及新的工程化策略（如条件性激活连接子）的出现，ADC连接子将继续朝着更精准、更安全、更有效的方向发展，从而为癌症患者带来更多获益。

参考资料：

1.Lysosomal-Cleavable Peptide Linkers in Antibody-Drug Conjugates. Biomedicines. 2023 Nov 16;11(11):3080.

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