反常识！PROTAC的中等亲和配体凭什么吊打高亲和？

PROTAC（Proteolysis Targeting Chimera）技术作为近年来生物医药领域的革命性突破，凭借 “靶向蛋白降解” 的独特机制，为传统“不可成药”靶点的药物研发提供了全新路径。长期以来，配体-靶蛋白亲和力被默认为 PROTAC 降解效率的核心决定因素，业内普遍存在 “配体亲和度越高，PROTAC 降解活性越强” 的认知惯性，高亲和配体成为研发首选。

然而，近期发表于Angewandte的重磅研究，通过系统性实验验证，揭示了中等亲和配体（Kd 处于纳摩尔至微摩尔级别），在 PROTAC 介导的靶向蛋白降解中，展现出更均衡的高效性、选择性与成药潜力，为 PROTAC 的理性设计提供了新的科学范式。

“不可成药” 剪接体蛋白的靶向突破

1. USP39 的生物学功能与成药挑战

USP39（泛素特异性蛋白酶 39）作为剪接体核心组件，参与 U4/U6.U5 三小核核糖核蛋白复合物组装，对 RNA 剪接保真度至关重要，其功能异常与肿瘤发生、神经退行性疾病密切相关。然而，USP39 缺乏经典蛋白酶的催化活性口袋（关键催化残基组氨酸和半胱氨酸缺失），且主要通过表面构象与其他剪接因子相互作用，传统小分子抑制剂难以靶向结合，长期被归为 “不可成药” 靶点。

图1：USP39 表达构建体的结构域架构及筛选出的配体

2. 中等亲和配体的发现与优化

研究团队通过 DNA 编码库筛选（约 6 亿个化合物）与靶向生物活性库筛选（200 个化合物），双重平台共同识别出含噻唑骨架的中等亲和配体（USP39_B1、USP39_B2）。AlphaFold3 结构预测显示，USP39 包含无折叠的 RS 样结构域、核心锌指（ZNF）结构域和 USP 结构域，配体主要通过氢键与 π-π 堆积作用结合 ZNF 结构域的 Tyr142、Gly140 等残基，形成特异性相互作用（Kd=3 μM）。通过定点突变验证（Phe120、Leu123、Tyr142 三重突变后结合活性完全丧失），明确了配体与 ZNF 结构域的结合特异性。

进一步通过结构 - 活性关系（SAR）优化，将配体苯环氯取代基替换为间位氟原子（USP39_B3），结合亲和力提升至IC50=1.18 μM，同时保留了溶剂暴露的修饰位点，为 PROTAC 设计预留了 linker 连接空间。

图2：蛋白与分子互作

3. PROTAC 设计与性能验证

基于优化后的中等亲和配体，研究团队设计合成了 60 个 PROTAC 分子（20 个 VHL 介导型、40 个 CRBN 介导型），重点优化 linker 长度与化学组成：最终筛选出的 USP39_PROTAC_V1 采用 PEG3 linker 增强水溶性，通过 VHL E3 连接酶介导降解，其与 USP39 的结合亲和力达 Kd=136 nM（ITC 验证），三元复合物形成常数 Kd=232 nM（Alpha assay 验证），显著优于亲本配体。

细胞层面，USP39_PROTAC_V1 展现出强效降解活性：1 nM浓度处理 24 小时即可实现 HeLa、HEK293T、LNCaP 等多种细胞系中 USP39 的高效降解，6 小时处理的 DC50 为 5 nM，24 小时 DC50 降至 1.06 nM；浓度高于 500 nM 时观察到明显hook effect。蛋白质组学分析（覆盖 6000 余种蛋白）显示，除 USP39 外，仅 应激相关蛋白 NDRG1 和 ISG15 出现轻微下调，同源蛋白 USP5、USP10 无明显变化，证实其高靶向选择性。

研究发现噻唑类配体，分子与 USP39 的结合主要依赖特异性氢键和芳香堆积作用，而非与蛋白深部疏水口袋的相互作用，且显著诱导了 USP39 的热稳定性下降。配体结合通常会提高激酶这类具有明确疏水空腔蛋白的热稳定性，因此配体诱导的蛋白稳定性降低并不常见。但对于缺乏结构化结合口袋的蛋白（如多结构域支架蛋白或 RNA 结合蛋白），则可能出现这种相反的效应。对于缺乏经典催化口袋的 USP39 而言，小分子化合物的结合很可能扰乱了其表面维持稳定性的环状结构，或改变了锌指结构域的构象，进而降低了蛋白的整体稳定性。因此，研究证实，化学诱导的邻近效应能够有效靶向剪接体组分 USP39 这类传统意义上的不可成药蛋白。研究结果强调，中等亲和力配体可通过 PROTAC 技术驱动高效且特异的蛋白降解，这也凸显了在促进三元复合物高效形成的过程中，结合动力学特性比绝对亲和力更为关键。

图3：PROTACs可实现细胞内 USP39 的高效、特异性降解

无独有偶，Chessum等人成功开发了针对非催化蛋白Pirin的PROTAC——CCT251236，虽然它只是中等亲和配体，但其具有良好的口服生物利用度、半衰期以及极佳的体外细胞活性，成药特性尤为突出。同样，Han等人开发针对雄激素受体（AR）的PROTAC——ARD-69，其虽然与目标蛋白或E3连接酶之间只有适度亲和力，却仍可实现显著降解，在细胞与动物实验中展现出卓越性能：在 LNCaP、VCaP 和 22Rv1 三种 AR 阳性前列腺癌细胞中，DC50 分别低至 0.86 nM、0.76 nM 和 10.4 nM，最大降解率（Dmax）均超过 95%。

图4：A. CCT251236；B. ARD-69

中等亲和配体的核心优势与机制解析

1.规避hook effect，稳定三元复合物的形成

PROTAC 的降解效率依赖“靶蛋白 - PROTAC-E3 酶” 三元复合物的动态平衡。中等亲和配体的结合强度适中，既能保证与靶蛋白的特异性相互作用，又能为 E3 酶的招募预留足够空间构象，使三元复合物在较宽浓度范围内保持稳定，避免高亲和配体因过度结合导致的桥梁断裂。

2. 提升靶向选择性，降低脱靶风险

高亲和配体多通过强疏水相互作用结合靶蛋白，易与结构同源蛋白交叉反应；而中等亲和配体的结合更依赖靶蛋白特有的构象特征，（如 USP39 的锌指结构域、Pirin 的特定表面环），这种 “构象依赖性结合” 显著提升了配体的靶向特异性。此外，蛋白质组学数据显示，基于中等亲和配体的 PROTAC 脱靶降解事件极少，安全性优势显著。

3. 优化理化性质，改善成药潜力

中等亲和配体无需过度依赖疏水相互作用增强结合，结构设计更灵活，易实现水溶性、脂溶性及代谢稳定性的平衡，如 CCT251236 在小鼠体内虽然未结合清除率高，但其成药性良好， 降低了 PROTAC 从实验室走向临床的转化难度。

参考文献：

• Han, X., et al. Discovery of ARD-69 as a Highly Potent PROTAC Degrader of Androgen Receptor for the Treatment of Prostate Cancer. J. Med. Chem. 2019, 62, 941−964.

• Schäfer, D., et al. Targeting the Spliceosomal Protein USP39 Through Allosteric Ligands and PROTAC-Induced Degradation. Angew. Chem. Int. Ed. 2025, e16809.

• Cheeseman, M. D., et al. Discovery of a Chemical Probe Bisamide (CCT251236): An Orally Bioavailable Efficacious Pirin Ligand from a Heat Shock Transcription Factor 1 Phenotypic Screen. J. Med. Chem. 2017, 60, 180−201.

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