动物行为实验指南丨镇静和应激状态下的社交互动范式

与处于镇静状态的同类进行社交互动

镇静的概念涵盖了一系列的反应水平，从相当于抗焦虑的轻度镇静到相当于全身麻醉的深度镇静。处于镇静状态的动物的反应丧失程度取决于镇静的程度。深度镇静的动物反应极小，大多保持不动，仅对外部刺激表现出细微的动作（如尾巴抽搐）。轻度镇静的动物（例如给予较低剂量镇静剂的动物或从镇静状态部分恢复的动物）对外部刺激会表现出更多的运动行为（如头部或身体的小幅动作）。

在行为测试前，成对的动物（雄-雄、雌-雌或雄-雌配对）至少有3天时间适应人工操作流程。一只动物被指定为 “帮助者”，另一只被指定为 “伙伴” 或 “接受者”。对于与清醒伙伴的互动，将伙伴从原居住笼中取出，放在单独的笼子里15分钟。对于与镇静伙伴的互动，给伙伴腹腔注射右美托咪定（剂量为0.3毫克/千克体重，然后将其放在单独的笼子里15分钟，使其进入深度镇静状态（以躺卧或蹲伏姿势在一个位置保持不动）。然后将伙伴与帮助者在原居住笼中重新放在一起，并记录20分钟内的行为。量化不同行为持续时间的起始时间点设定为清醒或镇静的伙伴被引入后的那一刻。在同一对动物中，与清醒伙伴的互动评估在与镇静伙伴互动的24小时前进行。

为了比较在光照和黑暗条件下帮助者对镇静伙伴的行为，在白光照明或红外光照明下按照上述方法进行行为学实验。这两组实验在同一对动物上相隔24小时进行，并且在不同动物间对光照和黑暗条件的顺序进行了交叉平衡。

为了研究当伙伴从清醒状态转变为无反应状态时帮助者的行为，给伙伴腹腔注射右美托咪定（0.3毫克/千克体重），注射后立即将其放回原居住笼与帮助者团聚。记录20分钟内的行为。无反应状态的开始定义为伙伴停止移动并在一个位置保持不动，采取躺卧或蹲伏姿势的那一刻。

为了研究帮助者对轻度镇静和深度镇静伙伴的行为，给伙伴腹腔注射右美托咪定，深度镇静的剂量为0.3毫克/千克体重，轻度镇静的剂量为0.03毫克/千克体重，然后将其放在单独的笼子里15分钟。然后将伙伴放回原居住笼与帮助者团聚，并记录20分钟内的行为。这两组实验在同一对动物上相隔24小时进行。在不同动物间对轻度镇静和深度镇静的顺序进行了交叉平衡，这些测试使用的是雄性小鼠。

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为了研究在有无笼伴的情况下动物从镇静状态的恢复情况，给动物腹腔注射右美托咪定，然后将其放在一个新笼子里，要么单独放置（“独处”），要么与一个帮助者一起放置（“有帮助者陪伴”）。在深度镇静状态下，动物大多保持不动，以躺卧或蹲伏姿势待在一个位置。当它们逐渐恢复清醒时，它们开始恢复站立姿势，在一个位置保持时表现出轻微动作，最终开始持续的探索性移动，离开它们最初的位置。尽管从镇静到清醒的转变是一个自然的渐进过程，将动物首次从最初位置开始持续移动所花费的时间量化，以此作为恢复速度的衡量指标。潜伏期计算为腹腔注射到首次持续探索性移动之间的时间。量化帮助者动物在伙伴恢复前5分钟和恢复后5分钟内对伙伴表现出的理毛行为（头部理毛）的持续时间。

三箱偏好测试：

三箱偏好测试在一个三室装置中进行，该装置由两个侧室（25厘米×25厘米）和一个中央室（12.5厘米×25厘米）组成。每个侧室中都放置一个金属丝网杯。让动物自由探索这三个室20分钟，其中一个金属丝网杯下有一只同性别的镇静动物，另一个金属丝网杯下有一只同性别的清醒动物，或者一个金属丝网杯下有一只同性别的镇静动物，另一个金属丝网杯下有一个玩具动物。在所有帮助者动物中，对各个室的分配进行了交叉平衡处理。在一组实验中，对于帮助者小鼠来说，镇静动物和清醒动物都是陌生的。在另一组实验中，对于帮助者小鼠来说，镇静动物和清醒动物都是熟悉的。

为了研究与镇静动物的先前互动是否会影响帮助者对该镇静动物相对于清醒动物的偏好，首先让帮助者自由地与镇静动物互动30分钟，然后在90分钟的间隔后，让其对同一只镇静动物进行三室测试。这些测试使用的是雄性小鼠。

与处于应激状态的同类进行社交互动：

在行为测试前，同性且成对饲养的动物至少有3天时间适应人工操作流程。随机指定一只动物为 “帮助者”，另一只为 “伙伴” 或 “接受者”。对于与无应激伙伴的互动，将伙伴从原居住笼中取出，放在单独的笼子里30分钟。对于与处于应激状态伙伴的互动，将伙伴从原居住笼中取出，放在束缚器中30分钟。然后将伙伴放回原居住笼与帮助者团聚，并记录13分钟内的行为。在同一对动物中，与无应激伙伴的互动评估在与处于应激状态伙伴互动的24小时前进行。为了比较帮助者对处于应激状态伙伴和无反应伙伴的行为，对社交互动最初13分钟内的行为进行比较。

头部理毛和身体理毛行为分别定义为可见的舔舐和/或嘴部接触，分别作用于另一只小鼠的头部（面部、嘴部和耳部）和身体（躯干、四肢和尾巴），在此期间，行为实施小鼠表现出表明舔舐动作的头部上下摆动。社交探究行为定义为帮助者小鼠靠近（在半个头长的范围内）另一只小鼠，并将鼻子朝向另一只小鼠进行嗅闻的时刻。

在实验前，雄性帮助者小鼠经过人工操作并适应至少3天。在与未经历过实验的、处于镇静状态和应激状态的动物互动期间进行成像，每只帮助者动物会与1至4只熟悉的雄性同类接触，这些同类处于未经历过实验、应激或镇静状态，每次接触持续约5至10分钟。通过将同类物理束缚30分钟来诱导应激状态。在与熟悉和陌生同类互动期间进行成像，每只帮助者动物会以交错的方式与陌生的清醒动物、熟悉的清醒动物、陌生的镇静动物和熟悉的镇静动物接触，总共使用三只陌生动物和三只熟悉动物。每次接触持续约5至10分钟，每次接触之间间隔约5分钟。

Fig1 不同状态下的社交互动

文献引用：

• Fangmiao Sun et al. ,A neural basis for prosocial behavior toward unresponsive individuals.Science387,eadq2679(2025).

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