ADC关键质量属性的分析方法

引言

分析方法是抗体药物偶联物开发用于临床试验和商业化的关键组成部分。各种分析方法已被用于产品表征、放行和稳定性测试，以及药代动力学和药效学研究。由于单克隆抗体的复杂性质，ADC的表征在很大程度上基于用于mAb的方法，此外还包括控制药物载量比和分布以及药物相关杂质的方法。ADC的分析方法开发应在非临床和临床研究开始前就启动，然后在ADC开发生命周期中进行优化，并在商业化前完成全面验证。

与mAb相比，ADC由于偶联的异质性，即药物抗体比、药物载量分布、位置异构体以及未偶联抗体和游离药物等额外产品变异体的存在，其复杂性水平增加。因此，为ADC选择的方法应适合其预期目的，如放行和稳定性或产品表征，并应考虑临床开发阶段和ADC的性质。本文将聚焦于为ADC设计的分析方法，重点关注其特殊考虑和挑战，特别是用于放行、稳定性和表征的方法以及产品属性。

一、药物抗体比与药物载量分布的测定

药物载量的表征包括测量平均DAR、药物载量分布、药物载量变异体和位置异构体的分析方法。DAR是ADC表征、放行和稳定性测试中的关键质量属性之一。它测量与mAb共价结合的细胞毒性药物的平均数量。在一定范围内，DAR通常与ADC的效力相关。高水平的DAR通常与细胞毒性水平的增加相关。

1 药物抗体比的测定

DAR的测定依赖于多种分析方法，包括紫外分光光度法、电喷雾电离质谱、疏水相互作用色谱和反相高效液相色谱。用于放行和稳定性测试的DAR测定方法取决于药物-连接子的物理化学性质以及mAb与药物-连接子之间的偶联化学，例如赖氨酸侧链的胺基、链间二硫键还原后的半胱氨酸巯基或mAb中特定位点的工程化半胱氨酸残基。

疏水相互作用色谱：对于通过硫醚键偶联到mAb半胱氨酸残基的药物，DAR通常使用HIC测定。DAR是根据HIC色谱图中每个偶联变异体的相对丰度，为ADC样品中的每个偶联物种计算得出的。

紫外分光光度法：对于通过抗体赖氨酸残基偶联的药物，DAR通常使用紫外光谱法测定。使用该方法时，DAR是基于在相应波长下测量的药物-连接子和抗体的峰值吸光度值及其消光系数计算的。然而，该方法有其局限性，例如缺乏特异性，因为它基于游离抗体和游离药物的水平非常低，因此测量的总抗体和药物-连接子与偶联抗体和药物-连接子的值没有显著差异的假设。该方法还要求ADC样品纯净，没有在抗体和药物-连接子吸收波长处也吸收的干扰组分；并且抗体和药物-连接子的峰值吸光度要充分分离。

质谱法：通过天然MS分析获得的药物载量分布可用于通过计算每个抗体和药物-连接子积分峰的加权峰面积并将所有观察到的物种的加权峰百分比相加来获得平均DAR。该方法作为批放行和稳定性测试的应用较少。

2 药物载量分布

即使对于包含相同平均DAR的ADC，药物在mAb上的分布也可能不同。研究表明，不同的药物载量物种在体内可能具有不同的清除率。然而，对于给定的DAR，不同的药物载量分布是否会有不同的活性，从而影响临床疗效和安全性，目前尚未有文献记载。

已使用多种方法来表征药物分布，即HIC、LC-MS、RP-HPLC、IEF等。药物载量分布通常用作产品表征工具。由于没有数据证明具有特定DAR的药物分布是否会对临床安全性和有效性产生任何影响，建议在产品放行和稳定性时进行该测试。该测试对于评估制造变更以进行ADC质量可比性非常有用。

赖氨酸偶联的ADCs：对于通过抗体赖氨酸残基侧链的胺偶联的药物，通常使用LC-MS分析来确定药物分布和未偶联抗体的水平。分析ADC样品的制备过程需要在非变性天然条件下进行。结果显示，每个抗体含有零到几个药物分子的药物载量物种的混合物。如果可以获得一系列DAR的ADC样品，可以进行分析以确定平均DAR与游离抗体含量之间是否存在相关性。

半胱氨酸偶联的ADCs：目前药物开发领域的大多数ADC属于通过部分还原现有的四个抗体链间二硫键，然后使产生的游离巯基与药物-连接子反应，形成药物-连接子与抗体通过硫醚键共价连接的半胱氨酸偶联ADC家族。对于这类半胱氨酸偶联的ADC，由于存在共价和非共价结合的轻链和重链的混合物，所有完整分析都必须在天然条件下进行以维持重链和轻链IgG链的非共价结合，因此存在分析挑战。因此，ADCs不能通过LC-MS方法轻易分析，因为该方法通常使用苛刻的溶剂条件，这会破坏抗体轻链和重链之间的一些非共价结合。尽管优化的LC-MS方法可用于分析药物分布，但分析HIC更常用于解析和定量含有不同量偶联药物-连接子的半胱氨酸偶联ADC的分布。该方法利用了药物-连接子附着在半胱氨酸残基上赋予ADC的增强的疏水特性。使用非变性和相对温和的条件实现分离，这保留了由共价和非共价结合组合保持在一起的各种药物载量变异体的抗体亚基。DAR是为每个药物载量变异体确定的。溶液中存在的加权平均DAR可以根据单独解析的MR变异体的相对丰度计算得出。通过使用此方法，解析出药物载量变异体的分布范围从每抗体0到8个药物。由于一个还原的二硫键产生两个硫醇基团，偶数药物载量的变异体更丰富，尽管也观察到含有奇数药物-连接子的药物载量变异体。如果偶联反应设计良好且受控，也可以定量未偶联抗体，并且通常以低水平存在。

二、ADC浓度

ADC浓度是通过测量ADC溶液在特定紫外波长下的吸光度，然后使用ADC的摩尔吸光系数计算其浓度来确定的。ADC的摩尔吸光系数是mAb和药物-连接子的总和，可以通过紫外光谱仪实验确定。抗体的摩尔吸光系数可以从理论值获得，并应通过实验确认。ADC的理论比吸光度常数是通过将其摩尔吸光系数除以抗体的平均分子量来建立的。使用此比吸光度常数确定的浓度仅反映ADC的蛋白质组分（即mg/mL蛋白质），不包括偶联的药物-连接子的质量。该测试是确定ADC药物产品效力的分析方法，用于计算给患者施用的临床剂量。该测试在放行和稳定性时进行。

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三、药物相关杂质

药物相关杂质由游离药物、游离药物-连接子和淬灭的药物-连接子组成。RP-HPLC用于定量ADC中存在的游离药物相关物质的量。ADC样品用有机溶剂提取，该溶剂沉淀裸露的和药物偶联的抗体。含有未偶联药物相关物种的上清液使用对药物-连接子特异的波长通过RP-HPLC进行分析。对应于药物相关物质的峰使用针对该杂质特异性的参考标准进行定量。游离药物相关物种的浓度表示为总药物含量（游离与结合加游离）的百分比。总药物含量是通过未进行溶剂提取或沉淀的原始ADC样品的紫外光谱法确定的。该测试在ADC放行和稳定性时进行。ADC中的药物相关杂质应通过非临床研究进行限定；然而，有时临床批次中的水平是通过可用的安全性数据来证明其合理性的。

RP-HPLC方法广泛用于小分子活性药物成分的分析，因为该方法成熟，并为分析（含量）和杂质提供了优异的峰形、特异性、重复性、分辨率和物料平衡。为ADC中的药物-连接子物质开发RP-HPLC方法具有独特的挑战，因为药物-连接子可能在样品制备过程中或在HPLC分析的水性流动相中降解。这可能导致色谱图中出现伪峰，并导致误导性的杂质含量结果。因此，RP-HPLC方法开发通常侧重于优化样品制备和流动相以稳定药物-连接子并最小化降解。当分析反应性药物-连接子中间体时，关键色谱条件是在各种条件下（如pH和温度）对药物-连接子反应的化学动力学进行研究后优化的。反应速率用于指导选择最佳稀释剂、流动相、pH和柱温以最小化柱上降解。该测试应开发为稳定性指示方法，应在放行和稳定性时进行。

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四、抗原结合活性

监测抗原结合的分析方法对于确保产品的效力至关重要。该分析还有助于评估偶联过程或药物分子本身是否影响抗原结合。药物，根据其位置和偶联化学，可能影响抗原结合。一项研究评估了药物载量对同一抗CD22 mAb上偶联的DM1和半胱氨酸偶联的MMAF的抗原结合的影响。该研究表明，DM1偶联会干扰抗原结合，并估计每个mAb一到四个DM1分子足以对抗原结合产生负面影响。

如果足够量的抗原可以以重组形式获得，并且抗原被抗体识别的方式与细胞上表达的抗原相似，则通常选择ELISA分析。甚至可以使用细胞的纯化蛋白质部分，而不是纯化的抗原，尽管此类分析需要额外的对照并且可能难以标准化。在ELISA分析中，通常将抗原或其一部分固定，mAb或ADC在溶液中使用。可以使用标记有过氧化物酶或碱性磷酸酶的抗Ig二抗检测结合产物。ELISA只能提供相对结合。相比之下，基于表面等离子体共振（SPR）的方法可以产生实际的亲和力。SPR的缺点是需要特殊的仪器和专业知识，并且方法优化可能具有挑战性。例如，极慢的解离可能难以测量，因此无法确定解离速率。在这种情况下，仍然可以通过绘制平衡结合水平与分析物浓度的关系图，使用稳态分析来估计亲和力（KD）。此外，相互作用过程中的构象变化，一个相对常见的现象，将需要使用双态拟合模型而不是1:1拟合来获得KD，这带来了其自身的挑战。重要的是要记住，使用SPR，只有当使用单价蛋白质（通常是抗原）在溶液中时才能确定KD，因为使用完整mAb在溶液中的不适当分析设计仍然被发表。

如果抗原不能以纯化形式获得，细胞结合分析可能是一种选择。需要表达内源性或转染抗原的合适细胞。此外，ADC对细胞的非特异性结合必须很低。由于许多ADC靶向的抗原设计为在结合后迅速内化，因此必须通过减少孵育时间、使用固定细胞和/或在0-4°C下进行分析来最小化抗原-ADC复合物的内化。细胞结合分析可以设置为板式格式，在这种情况下，检测通常类似于ELISA分析，通常作为直接结合分析。或者，可以使用流式细胞仪和荧光标记的二抗进行细胞结合分析。在任何这些情况下，重要的是评估浓度依赖性的ADC结合以估计样品的相对亲和力。

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五、细胞毒性分析

ADC的预期作用机制是抗原特异性的、药物依赖性的细胞毒性。因此，使用表达抗原的细胞进行的体外细胞毒性分析是用于放行和稳定性研究中的关键效力分析。细胞增殖和活力分析是评估细胞毒性的首选方法。

细胞增殖可以通过直接计数活细胞来评估，或者更方便地通过间接估计细胞增殖来评估。间接分析使用在S期活跃复制的细胞中掺入的核苷类似物，包括放射性胸苷或5-溴-2'-脱氧尿苷。不增殖但存活的细胞在这些分析中检测不到。尽管细胞增殖分析非常敏感和定量，但作为放行或稳定性分析实施具有挑战性。

细胞活力分析主要有两种类型。第一种分析类型是阳性检测凋亡细胞。细胞可以用碘化丙啶和荧光标记的膜联蛋白共染色，并通过流式细胞术检测各种细胞群。碘化丙啶被晚期凋亡和坏死细胞摄取，而膜联蛋白V与早期凋亡以及晚期凋亡和坏死细胞上存在的膜磷脂酰丝氨酸结合。也可以通过检测caspase 3和7的活性来识别凋亡细胞。例如，Caspase-Glo® 3/7分析是一种发光分析，测量裂解细胞中的caspase 3/7活性。凋亡分析具有信息量，但需要在优化的精确时间点进行测试。此外，由于低浓度的ADC可能不会有效诱导凋亡，敏感性可能会降低。这些分析在表征研究中很有用，但作为放行或稳定性分析使用面临重大挑战。

第二种类型的分析基于区分活细胞和死细胞的代谢标志物间接测量活力。这些标志物包括细胞内ATP、乳酸脱氢酶（LDH）、NADH、蛋白水解酶和氧化还原环境。分析中获得的信号与活细胞数量成正比。此类分析可以敏感并提供宽动态范围，因此被广泛使用。应该考虑的是，一些代谢标志物可能受到刺激或分析条件的调节，可能不纯粹反映细胞数量的变化。活细胞中四唑盐的还原，结合比色检测，被广泛用于测量活细胞数量。ADC分析中使用的四唑盐包括MTT、MTS和WST-8。Resazurin是另一种氧化还原敏感染料，以各种商品名提供，具有低毒性并允许更长的孵育时间，因此经常使用。CellTiter-Fluor™试剂盒也用于细胞毒性分析，使用被活细胞中特定蛋白酶转化为荧光产物的肽底物。

到目前为止讨论的分析方法在单个时间点评估细胞毒性。正在开发提供实时动力学测量的新技术。此类分析提供了独特的优势，因为可以评估ADC细胞毒性作用的时间过程。Essen BioSciences提供基于标记的动力学增殖分析IncuCyte ZOOM，它使用自动化显微镜成像基于面积（汇合度）测量细胞生长。同一平台同时使用荧光caspase 3/7试剂评估凋亡。Roche Applied Science的xCELLigence技术测量细胞对印刷在板上的金电极阵列的粘附。这两种技术都是无标记的，能够检测细胞形态，但目前仅限于贴壁细胞。我们尚未知悉任何用于ADC测试的已发表研究。

由于细胞毒性分析被用作主要的效力分析，它们应足够准确以确保跨不同药物产品批次的正确患者给药。此外，效力分析的批放行验收标准应足够严格，以确保患者不会因引入效力超出预期的批次而用药过量。对于ADC，由于其潜在的毒性，剂量递增通常以小步长执行。例如，如果临床剂量递增计划以两倍步长推进，50-150%的相对效力分析规格，对应于三倍范围，可能不够严格。如果由于分析限制无法收紧规格，则可能需要限制在临床研究中使用更多批次。

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六、Fc依赖性效应功能分析

尽管对于ADC，药物组分引起的细胞毒性是预期的初级作用机制，但额外的机制可能有助于其效力。mAb的同种型具有重要意义，因为对于能够参与Fc依赖性效应功能的同种型，这些活性可能是体内作用机制的一部分。特别是IgG1抗体能够结合Fcγ受体和C1q，因此可能参与ADCC、ADCP和CDC等效应机制。因此，评估mAb组分是否具有参与Fc相关效应机制的能力非常重要。事实上，据报道，几种ADC具有额外的作用机制。Trastuzumab-DM1保留了抗HER2 mAb曲妥珠单抗的所有作用机制，包括ADCC、抑制细胞增殖和抑制HER2脱落。另一种靶向CD37的DM1偶联ADC显示出强效的ADCC、ADCP和CDC活性，其中ADCC被证明与亲本mAb相当。另一方面，一种为减少Fcγ-受体结合而工程化的抗CD70 IgG1 ADC在小鼠肿瘤模型中出人意料地改善了疗效，可能是由于药代动力学增强所致。

监测Fc依赖性效应功能的分析可以是基于细胞的或无细胞的。基于细胞的分析执行方式与ADC和mAb类似，尽管对于ADC需要额外的对照来证明靶细胞毒性与药物无关。传统的ADCC分析使用原代NK细胞或PBMC作为效应细胞，而新颖的分析使用能够进行高效FcγRIII依赖性杀伤的人NK细胞系。使用NK细胞系具有显著优势，即减少了使用原代细胞进行的ADCC分析中众所周知的巨大变异性。在这两种类型的ADCC分析中，抗原阳性靶细胞用一系列浓度的mAb或ADC包被，孵育数小时后测量靶细胞裂解。细胞裂解可以通过测量细胞内标记物或标志物的释放来定量，包括铬51、resazurin染料和LDH。CDC分析使用与ADCC分析相似的靶细胞和检测方法，并添加人或动物血清作为补体来源。尽管ADCP可能有助于许多mAb的作用机制，但由于开发足够特异性和敏感的吞噬作用分析的困难，这种潜力很少被评估。使用原代单核细胞衍生的巨噬细胞作为效应细胞，通过流式细胞术检测记录靶细胞和效应细胞的双阳性事件，已显示了一种ADC的ADCP活性。

无细胞分析基于测量mAb与Fcγ受体或C1q的直接结合。分析可以基于ELISA或SPR格式，并且与ADC和mAb的执行方式相同。ELISA通常用于测量C1q结合。一项已发表的分析涉及将一系列浓度的mAb样品固定，并使用HRP标记的抗C1q抗体测量可溶性C1q结合。最近发表了一项测量C1q结合的SPR分析。相比之下，Fcγ-受体结合通常使用SPR进行评估。mAb或Fcγ受体直接固定或捕获在传感器上，另一个分子在溶液中使用。大多数Fcγ受体与IgG结合具有快速动力学，对于此类相互作用，通常使用稳态分析来估计KD。

这些分析作为表征研究的一部分进行，使用未偶联的mAb、ADC或理想情况下两者，在这种情况下可以评估药物偶联的影响。mAb应表征其Fc相关效应功能。如果认为ADC具有多种作用机制，则可能需要执行额外的效力分析，作为mAb中间体和/或药物物质和药物产品放行测试的一部分。如果mAb被工程化以减少效应功能，则应在表征期间证明这一点。在开发早期，这些研究是为了在关键临床研究时更好地理解作用机制而进行的。

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七、免疫原性分析

ADC中使用的药物通常太小，无法自行引发免疫反应。然而，当偶联到载体蛋白如mAb上时，小分子可以触发免疫反应。ADC的另一个考虑是，疏水性药物可以增加其形成聚集物的能力，从而增加ADC引发免疫反应的可能性。ADC可能引发针对mAb、连接子或药物部分上存在的表位，或在两个组分界面处形成的新表位的免疫反应。尽管近年来没有报道因对mAb的免疫反应而导致的严重不良事件，但抗产品抗体可能对PK产生不利影响并降低疗效。对于ADC，在免疫复合物形成时，另一个担忧是将毒性药物递送到体内意外位置。在两种目前上市的ADC中，据报道brentuximab vedotin在美国处方信息中在7%的患者中引发持续性APA，而30%的患者被发现短暂阳性。在所有患者中，免疫反应均针对嵌合mAb组分。在62%的APA阳性患者中检测到中和抗体。两名（1%）具有持续性APA反应的患者因输注反应而停止治疗。在trastuzumab emtansine的情况下，据报道5.3%的患者APA阳性，而未测试中和APA。值得注意的是，trastuzumab emtansine报告的免疫原性率比接受trastuzumab治疗的患者发现的免疫原性高几倍，这表明ADC可能比mAb更具免疫原性。

ADC免疫原性测试中使用的方法与用于mAb的方法相似。检测结合抗体的抗体具有挑战性，因为没有试剂可以与抗体和抗抗体交叉反应。解决此问题的常见方法是桥接ELISA或电化学发光分析，其中一个APA分子连接两个产品分子，一个用于固定，另一个用于检测复合物。进一步偶联ADC以生成标记试剂可能带来挑战。相互作用的组分可以顺序添加或在固定前一起孵育以在溶液中形成复合物。分析优化中使用的阳性对照或对照至关重要。为了反映异质性APA反应，优选多克隆阳性对照抗体，而不是高亲和力mAb。或者，可以使用代表一系列亲和力的一系列阳性对照mAb。抗独特型mAb也可用作阳性对照。此外，建立分析对产品存在的耐受性很重要，因为样品通常在循环产品仍然存在的时间点收集。可以通过在分析中加入酸解离步骤来增加分析的药物耐受性，在该步骤中，用酸处理血清样品以解离产品-APA复合物。

免疫原性分析也可以基于SPR分析。SPR在检测高亲和力抗体方面可能不如其他方法敏感，但具有检测低亲和力抗体，特别是那些具有快速解离的抗体的优势。SPR分析可以适应包括酸处理以增加药物耐受性。使用SPR，可以直截了当地使用一系列同种型特异性抗体来表征APA的同种型，但不能使用与产品结合的抗同种型抗体。可以使用二抗来增加SPR信号并提高分析敏感性。开发并合格了一种同时表征APA同种型和结合区（Fc或Fab）的SPR分析。在该分析中，生物素化的全长tociluzumab、Fc或Fab片段被固定在单独的流通池上，然后将血清样品注入所有流通池，随后是同种型特异性抗体。这种分析格式可以适用于ADC，以检测针对mAb、连接子和药物组分的APA，尽管我们尚未知悉已发表的报道。

对于ADC，一个重要的考虑是评估APA是针对mAb、连接子还是药物部分引发的。Hoofling及其同事开发并测试了两种评估表位的方法。一种分析是使用未标记的mAb或药物偶联的BSA作为竞争剂的竞争分析。另一种分析在检测步骤中使用标记的mAb或药物偶联的BSA。使用在过量抗mAb抗体存在下用低浓度抗药物抗体加标的样品，或反之亦然，测试了两种分析的特异性。发现竞争分析产生假阴性结果。相比之下，直接分析的特异性得到确认，除非存在非常大量的抗主要表位的抗体。

承认开发合适的免疫原性分析存在许多挑战，FDA支持在产品开发期间逐步开发和验证分析，除非认为发生APA相关不良事件的风险很高。在分析和测试被开发和合格之前，患者的样品应在适当的储存条件下储存。对于ADC，建议开发能够区分对mAb和药物组分的免疫反应的分析。

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结语

由于ADC的复杂性质，一些QC测试在偶联前的中间体上执行可能更有效。例如，药物-连接子相关杂质在药物-连接子中间体阶段通过完整的杂质谱分析进行控制。这些杂质可以分为可偶联和不可偶联的杂质。在控制这些杂质时应采用基于风险的方法。对于mAb的表征和放行测试，应在mAb中间体阶段和ADC上测试相关属性，以便进行比较以确定偶联是否导致质量属性的任何变化。通常，mAb和药物-连接子中间体的表征、放行和稳定性测试应与DS的方式相同。

鉴于ADC的复杂性以及该领域当前不断发展的科学和技术，本文讨论的分析方法开发策略包括制药行业中常用的方法。它们可能不适用于每个单独的ADC。在开发QC分析时，建议咨询并酌情应用相关的ICH指南。

参考文献：

1.Antibody-Drug Conjugates Fundamentals, Drug Development, and Clinical Outcomes to Target Cancer (Kenneth J. Olivier Jr., Sara A. Hurvitz (eds.))

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