东北师范大学陈莉教授ACS Nano：聚氨基酸抗真菌材料问世，10分钟高效杀菌且不易耐药

侵袭性真菌感染已成为日益严峻的全球公共卫生问题，每年报告的由真菌病原体引起的浅表性和致命性感染病例超过650万例。然而，当前抗真菌药物种类有限，且随着耐药真菌菌株的不断出现，传统药物的疗效逐渐下降。耐药危机因传统药物的长期使用、生物利用度低以及单一作用机制而进一步加剧，凸显了对能够靶向真菌细胞膜完整性、细胞内结构和关键代谢途径等多种生物学层面的创新抗真菌疗法的迫切需求。

近期，东北师范大学陈莉教授、中国科学院长春应用化学研究所‌肖春生研究员、Wan Pengqi博士合作合成了一种具有“噬菌体式”作用过程的胍基功能化聚氨基酸材料PArg₂₀，它展现出卓越的抗真菌活性和良好的生物相容性。该材料模拟噬菌体的三步感染过程，通过“吸附-穿透-破坏”的级联作用高效杀灭真菌。与临床常用药物相比，PArg₂₀将根除真菌所需的时间从超过2小时缩短至仅10分钟，并且在连续传代15次后未显示出明显的耐药性倾向。在小鼠角膜和全身性真菌感染模型中，PArg₂₀能显著降低真菌负荷和炎症反应。相关论文以“Membrane-Targeting Poly(Amino Acids) with a Phage-Like Action Process for Antifungal Therapy”为题，发表在ACS Nano上。

示意图1. (A) PArg₂₀基于其通过抗真菌活性和选择性指数筛选的最佳性能而被选中。(B) PArg₂₀展现出包含三个连续步骤的噬菌体样作用过程：吸附、穿透和破坏，从而有效破坏真菌细胞。(C) PArg₂₀通过破坏膜稳态和触发细胞内氧化应激反应诱导真菌细胞死亡。

研究团队首先通过α-氨基酸N-羧酸酐的开环聚合，合成了一系列不同聚合度的富胍基聚氨基酸材料，并从中筛选出性能最优的PArg₂₀。合成与表征数据（图1）证实了材料的结构可控性与高纯度。体外抗菌活性评估（图1F-J）显示，PArg₂₀对多种白色念珠菌标准菌株具有高效抑制和杀灭作用，其抗菌活性呈现明显的链长依赖性，且对哺乳动物细胞的毒性很低，选择性指数优异。

图1. PArgₙ的合成、表征及活性。 (A) 通过聚合、脱保护和胍基化合成PArgₙ的路线。(B) POrn₂₀和PArg₂₀的化学结构。(C) POrn₂₀和PArg₂₀的¹H NMR谱图。(D) POrn₂₀和PArg₂₀的¹³C NMR谱图。(E) POrn₂₀和PArg₂₀的FT-IR谱图。(F) PArgₙ对白色念珠菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的MIC和MFC值。MIC和MFC值显示为MIC/MFC (μg/mL)。(G,H) HC₅₀及相应的选择性指数(HC₅₀/MIC)。(I,J) IC₅₀及相应的选择性指数(IC₅₀/MIC)。

为了评估其长期有效性，研究进行了连续传代诱导耐药实验（图2A-B）。结果显示，在连续15代暴露于PArg₂₀后，白色念珠菌对其最小抑菌浓度未发生改变，而对照药物氟康唑则出现了约16倍的耐药性增长，表明PArg₂₀不易诱导耐药。此外，PArg₂₀在极端pH、高温或紫外线照射等苛刻条件下仍能保持稳定的抗真菌活性（图2D-E），显示出优异的理化稳定性。

图2. PArg₂₀的体外抗真菌性能。 (A) 用于诱导耐药性的连续传代实验方案示意图。(B) 白色念珠菌在连续暴露于FLZ (1/2 × MIC)、PArg₂₀ (1/2 × MIC) 或两者组合 (FLZ 1/8 × MIC + PArg₂₀ 1/8 × MIC) 下的耐药性发展。(C) 24小时内的生长抑制动力学。(D) 不同pH条件下PArg₂₀的MIC和MFC值。(E) PArg₂₀和FLZ经热处理（100°C）和紫外线照射（254 nm）后的MIC变化。(F-I) PArg₂₀和PArg₅与临床抗真菌药物联用时的FICI值。(J) 用不同浓度PArg₂₀处理后，白色念珠菌表面Zeta电位的变化。(K) PArg₂₀诱导的白色念珠菌细胞质膜去极化。(L) PArg₂₀对白色念珠菌的靶向能力。比例尺代表10 μm。(M) 用不同浓度PArg₂₀处理后，白色念珠菌活/死染色的流式细胞术分析。

PArg₂₀与临床抗真菌药物联用表现出协同效应（图2F-I）。进一步的机理研究表明，PArg₂₀通过静电作用靶向并吸附于带负电的真菌细胞膜表面（图2J，L），引起膜电位去极化（图2K），但并不立即导致细胞裂解。实时共聚焦成像（图3A-C）清晰地展示了PArg₂₀从膜吸附、穿透到进入细胞质的动态过程，随后引发的细胞内红色荧光（PI）增强表明细胞膜完整性逐渐丧失。扫描和透射电镜观察（图3D-E）显示，PArg₂₀处理的细胞表面出现褶皱并覆盖一层不均匀物质，细胞内结构发生紊乱。

图3. PArg₂₀与真菌细胞膜相互作用的机制。 (A) 显示白色念珠菌被杀灭过程的延时共聚焦荧光图像。比例尺代表5 μm。(B,C) 10秒和300秒时的荧光共定位分析；插图中的白线表示线性共定位分析区域。(D) 用不同药剂处理后白色念珠菌的SEM图像和 (E) TEM图像。比例尺分别代表5、2和0.5 μm。(F) 用不同浓度PArg₂₀处理后，Annexin V-FITC/PI染色的流式细胞术结果。(G) 在不同PArg₂₀浓度下，白色念珠菌细胞死亡模式的定量分析。(H) PArg₂₀在高浓度和低浓度下的抗真菌机制示意图。

细胞死亡模式分析（图3F-H）揭示，低浓度PArg₂₀主要诱导细胞发生类似凋亡的死亡，而高浓度则直接破坏膜完整性，导致类似坏死的死亡。深入研究其细胞内作用机制发现，PArg₂₀会导致线粒体膜电位去极化（图4A-D）和细胞内活性氧水平升高。同时，该材料还能穿透细胞并与真菌DNA结合（图4E-G），计算模拟显示其与DNA具有高结合亲和力。

图4. PArg₂₀的细胞内作用机制。 (A) JC-1染色原理示意图，用于检测线粒体膜电位。(B) 共聚焦显微镜显示PArg₂₀处理后线粒体膜电位去极化（荧光从红变绿）。比例尺代表10 μm。(C,D) 流式细胞术定量分析不同浓度和时间点下线粒体膜电位的变化。(E) 共聚焦图像显示PArg₂₀-FITC（绿色）与Hoechst染色的DNA（蓝色）共定位，表明PArg₂₀与DNA结合。(F) PArg₂₀与DNA分子对接模拟图，显示结合位点和相互作用。(G) 琼脂糖凝胶电泳显示PArg₂₀引起DNA条带阻滞。

转录组学分析（图5）为理解PArg₂₀的作用提供了分子层面的见解。差异表达基因富集分析表明，PArg₂₀处理显著影响了与细胞壁生物合成、几丁质和氨基糖代谢以及膜锚定组分相关的基因表达，这与其破坏细胞膜和细胞壁稳态的机制相吻合。此外，PArg₂₀还表现出强大的抗生物膜活性（图6），不仅能抑制生物膜形成，还能渗透并清除已形成的成熟生物膜，这对于治疗与生物膜相关的顽固性感染具有重要意义。

图5. 抗真菌反应的分子通路。 (A) 白色念珠菌转录组测序示意图。(B) 转录组数据的2D和 (C) 3D主成分分析。(D) 样本间相关性热图。(E) 差异表达基因的火山图。(F) 显著富集GO术语的气泡图。

图6. 体外抗生物膜性能。 (A) 生物膜形成和PArg₂₀处理方案示意图。(B,C) 结晶紫染色的宏观和微观图像，显示对生物膜形成的抑制和对成熟生物膜的清除。比例尺代表200 μm。(D) 生物膜形成抑制的量化。(E) 成熟生物膜根除的量化。(F) 经或未经PArg₂₀-FITC处理的生物膜的3D共聚焦图像。比例尺代表50 μm。(G) 用SYTO9/PI染色的生物膜的3D共聚焦图像。比例尺代表100 μm。(H,I) 对照组和PArg₂₀-FITC处理组生物膜中DAPI和FITC的共定位分析。(J) 荧光渗透到生物膜中的量化。(K) 经或未经PArg₂₀处理的生物膜的活/死荧光比率分析。(L) PArg₂₀处理后生物膜厚度的测量。(M) 不同处理后生物膜的SEM图像。比例尺分别代表30和5 μm。

在体内实验中，PArg₂₀在小鼠真菌性角膜炎模型（图7）和系统性感染模型（图8）中均显示出强大的治疗功效。它能快速清除角膜和主要脏器中的真菌负荷，减轻组织损伤和炎症反应，并显著提高感染动物的存活率。重要的是，组织病理学检查和血清生化指标分析证实了PArg₂₀在体内具有良好的生物相容性和安全性。

图7. PArg₂₀在小鼠角膜炎感染模型中的功效。 (A) 角膜炎诱导和体内抗真菌评估示意图。(B) 治疗期间感染眼睛的代表性图像及第5天的荧光素钠染色。(C) 不同时间点的实时眼部荧光成像。(D) 第5天眼组织匀浆平板培养图像。(E) 治疗期间角膜炎的临床评分。(F) 第5天荧光素染色角膜损伤面积的定量分析。(G) 不同时间点眼部荧光强度的定量分析。(H) 第5天角膜匀浆的CFU计数。(I) 角膜组织切片的H&E和PAS染色图像。比例尺分别代表0.5 mm和50 μm。(J) 角膜组织切片中IL-1β和IL-6的免疫荧光染色图像。比例尺代表50 μm。(K) 角膜厚度的定量分析。(L,M) IL-1β和IL-6的定量荧光分析。

图8. PArg₂₀在小鼠系统性感染模型中的功效。 (A) 系统性白色念珠菌感染建模和体内抗真菌评估示意图。(B) 系统性感染小鼠的生存曲线分析。(C,D) 从感染小鼠收集的肝脏和肾脏组织的显微镜图像。(E) 感染小鼠肝脏和肾脏组织的H&E染色切片。比例尺代表50 μm。(F-K) 各器官匀浆组织的菌落图像和CFU计数。(L) 用于评估PArg₂₀体内生物安全性的主要器官H&E染色切片。比例尺代表50 μm。

综上所述，PArg₂₀作为一种通过独特“噬菌体式”过程发挥作用的新型抗真菌剂，展现出快速杀菌、不易耐药、作用机制多重、稳定性高以及体内外安全性好等综合优势。该研究不仅提供了一种对抗耐药真菌感染的有前景的新策略，其揭示的“吸附-穿透-破坏”作用范式也为未来设计多步骤、协同作用的抗微生物材料提供了新的思路。