FSHW | 地骨皮通过增强抗肿瘤免疫抑制非小细胞肺癌生长

本文系Food Science and Human Wellness原创编译，欢迎分享，转载请授权。

01

Introduction

非小细胞肺癌（NSCLC）占肺癌病例的80%以上，是全球癌症相关死亡的首位原因。作为一种难治性癌症，肺癌的治疗充满了挑战。免疫治疗是继手术、放疗、化疗和靶向治疗后的又一重大肿瘤治疗方式。膳食补充剂常被用于预防癌症、减缓癌症进展或提高免疫力，是一种很有前景的辅助治疗策略。

中药地骨皮（LRC）是枸杞的干燥根皮，具有凉血除蒸、清肺降火的功效，2002年被列入"药食同源"目录。现代药理学研究表明，地骨皮及其组分具有抗病毒、抗菌、降血脂、降压、降糖等多种药理活性。目前，关于地骨皮的抗癌作用研究极少，仅少量研究报道了地骨皮可促进胶质瘤细胞凋亡，抑制胶质瘤生长。迄今为止，已从地骨皮中分离出130多种成分。芹菜素是地骨皮中的一种膳食黄酮类化合物，具有广泛的生物活性，能直接抑制肺癌细胞生长或诱导细胞凋亡，还可以抑制血管生成，增强肺癌化疗敏感性，促进抗肿瘤免疫反应。蒙花苷同样是地骨皮中的膳食类黄酮，具有显著的抗炎、抑制肺癌细胞生长和侵袭等药理活性。这些组分的存在支持地骨皮“药食同源”的特性。

经典名方泻白散被用于治疗肺癌，地骨皮是泻白散的组成之一。然而，地骨皮对NSCLC的抗肿瘤作用及其机制尚不清楚。广州中医药大学中西医结合基础研究中心张韧课题组通过Lewis肺癌小鼠模型，探究地骨皮对肺癌的抑制作用及其机制，阐明了地骨皮能通过增强抗肿瘤免疫抑制非小细胞肺癌生长的作用机制。这项研究为地骨皮作为保健食品增强NSCLC患者抗肿瘤免疫提供了研究基础。

02

Results and Discussion

地骨皮可有效抑制体内肿瘤生长

体内实验结果显示，地骨皮显著降低了肿瘤体积（图1A和C）和重量（图1B），并未伴随显著的体重下降（图1D）。小鼠肝脏和肾脏的H&E染色结果显示地骨皮治疗没有毒性（图1E），表明小鼠对地骨皮治疗有较好的耐受性。先前的研究发现地骨皮不能抑制人NSCLC细胞株A549和H1299的增殖，与先前的研究一致，地骨皮在体外同样不能抑制小鼠肺癌细胞系LLC的增殖（图1F）。这些结果表明，地骨皮对LLC荷瘤小鼠NSCLC进展的抑制不是由于地骨皮的肿瘤选择性细胞毒性，这提示地骨皮可能通过免疫应答发挥其抗肿瘤作用。

图1地骨皮抑制小鼠肺癌的生长

地骨皮增强了机体的抗肿瘤免疫反应

为了验证地骨皮对抗肿瘤免疫反应的影响，首先观察了每组小鼠的免疫器官，发现地骨皮对脾脏（图2A）和胸腺（图2B）的质量没有明显影响。ELISA结果表明，与对照组相比，接受高剂量地骨皮治疗的小鼠血清中IL-2和IFN-γ（与T淋巴细胞活性相关）的水平显著升高（图2C和D）。为了进一步探索地骨皮对免疫的影响，对地骨皮处理组与对照组小鼠的脾脏进行了一般转录组测序。两组测序结果比较发现了5107个差异表达基因（2180个上调基因和2927个下调基因；图2E）。层次聚类分析表明，地骨皮治疗的小鼠基因表达谱发生了显著改变（图2F）。从测序数据中发现地骨皮显著上调了CD40lg、TCR、Zap70、Lck和TNF等参与T细胞活化的基因转录水平（图2G）。GSEA结果还显示地骨皮治疗与TCR信号通路和白细胞跨内皮迁移通路的上调显著相关（图2H，I）。这些结果表明地骨皮在免疫反应中发挥重要作用，并提示地骨皮诱导部分活化的淋巴细胞向肿瘤迁移。

图2地骨皮增强了机体的抗肿瘤免疫反应

地骨皮促进肿瘤中CD8+ T细胞的浸润和活性

为了探究地骨皮是否诱导了淋巴细胞向肿瘤组织迁移，对肿瘤进行了一般转录组测序，并对肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）进行定量。肿瘤组织H&E染色结果显示，地骨皮治疗组中TILs较对照组显著增加（图3A）。同时，TIMER数据库免疫浸润分析结果也显示地骨皮促进了CD8+ T细胞浸润（图3B，C）。GSEA分析进一步还发现，地骨皮促进了IL-12家族信号通路（与免疫效应细胞浸润密切相关），以及负调控T细胞凋亡过程（图3D，E）。这些结果表明地骨皮能促进肿瘤中的TILs浸润，并提示地骨皮可以减少T细胞凋亡。为了证实这一点，采用免疫荧光染色，发现地骨皮促进GZMB+CD8+ T淋巴细胞浸润到肿瘤组织中（图3F，G）。总之，这些结果表明地骨皮促进了肿瘤中CD8+ T细胞的浸润和活性。

图3地骨皮促进肿瘤中CD8+ T细胞的浸润和活性

地骨皮通过PD-L1/PD-1通路影响抗肿瘤免疫反应

接着探索了地骨皮对抗肿瘤免疫反应的作用机制。从脾脏mRNA测序数据GSEA结果中发现PD-1（程序性死亡受体1）的下游通路，包括RAS、MAPK、JAK-STAT和PI3K-Akt信号通路，均被地骨皮上调（图4A）。PD-1存在于T淋巴细胞膜上，与肿瘤细胞表面的PD-L1（程序性死亡受体配体1）结合后会导致T细胞自身细胞凋亡，促进肿瘤免疫逃逸。因此，推测地骨皮对抗肿瘤免疫应答的影响是通过PD-L1/PD-1通路介导的。构建了稳定过表达PD-L1的肺癌细胞株（A549-PD-L1-OE，图4B），并将其与PBMCs共培养，其中T淋巴细胞在体外用CD3/CD28抗体激活。共培养实验结果显示A549-NC和A549-PD-L1-OE细胞的凋亡百分比分别为64%和9%（图4C，D），PD-L1过表达显著抑制了活化PBMCs对肿瘤细胞的杀伤作用，而4 μg/mL和12 μg/mL LRC逆转了PD-L1过表达的作用，并提高了活化PBMCs的肿瘤杀伤效果。由于LRC对PBMC增殖的影响几乎可以忽略不计（图4E），这些结果证明LRC对抗肿瘤免疫反应的影响是由PD-L1/PD-1通路介导的。

图4地骨皮通过PD-L1/PD-1通路影响抗肿瘤免疫反应

地骨皮通过结合PD-L1抑制PD-L1/PD-1相互作用

A549-PD-L1-OE细胞中PD-L1的持续表达是外源性的，因此地骨皮对PD-L1/PD-1通路的影响（图4C，D）至少部分依赖于干扰PD-L1功能。因此，假设地骨皮抑制PD-L1/PD-1的结合。均相时间分辨荧光技术证实地骨皮能阻断PD-L1和PD-1的相互作用，IC50为519 μmol/L（图5A）。接着，使用生物膜干涉技术测定出地骨皮和PD-L1的KD值为1.9 μmol/L，表明两者有较好的亲和力（图5B）。上述实验结果证明地骨皮通过与PD-L1结合来阻断PD-L1和PD-1之间的相互作用。为了进一步证实这点，用PHA刺激Jurkat T细胞，使其产生PD-1（图5C）。然后用PD-L1蛋白孵育表达PD-1的Jurkat T细胞制备细胞模型，流式细胞术检测发现PD-L1增强了Jurkat T细胞的凋亡，而地骨皮有效地抑制了PD-L1介导的Jurkat T细胞凋亡诱导（图5D）。Western blot检测凋亡关键标志物Caspase 3，也证实了这一发现（图5E）。PD-L1诱导T细胞耗竭的原理是由于PD-L1与PD-1结合导致PD-1的细胞质尾部磷酸化并募集p-SHP2，从而去磷酸化下游多条通路，最终抑制T细胞的活化，随后定量分析了PD-L1孵育后的Jurkat T细胞中p-SHP2表达水平。结果显示PD-L1增加了p-SHP2水平，而地骨皮显著降低了由PD-L1引起的p-SHP2水平升高（图5E）。地骨皮对Jurkat T细胞的增殖没有抑制作用（图5F）。这些结果证实了地骨皮与PD-L1相互作用，抑制PD-L1/PD-1的结合。

图5地骨皮通过结合PD-L1抑制PD-L1/PD-1相互作用

03

Conclusion

本研究探讨了地骨皮的抗肺癌作用及其机制，证明地骨皮可与PD-L1结合并阻断其与PD-1的相互作用，恢复T淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。这些结果为地骨皮作为保健食品增强NSCLC患者抗肿瘤免疫提供了研究基础，也为进一步筛选靶向PD-L1的天然小分子抑制剂提供参考。

第一作者

尹衡，男，广州中医药大学基础医学院2021届硕士研究生，主要研究方向为中医药抗肿瘤免疫。目前主持广州市基础研究计划基础与应用基础研究项目1项，以第一或共一作者发表论文3篇。

通信作者

张韧，男，博士，副教授，硕士研究生导师。毕业于中山大学中山医学院，曾在加州大学戴维斯分校、亚拉巴马州立大学伯明翰分校学习。现任广州中医药大学中西医结合基础研究中心主任。讲授《医学免疫学》、《医学微生物学》、《细胞生物学》。从事药食同源中药及其活性成分在抗肿瘤免疫中的作用、机制以及新药开发研究。承担国家自然科学基金、广东省自然科学基金、广州中医药大学英才计划、广东省高校教学质量工程特色专业等项目。以负责人申请获批1项广东省一流本科专业建设点。以第一或通讯作者（含共同）在Cellular & Molecular Immunology、Phytomedicine、Phytotherapy Research等国内外期刊发表文章30余篇，其中SCI文章近20篇。获得中国发明专利授权2项。

Lycii Radicis Cortex suppresses the growth of non-small cell lung cancer via enhancing the anti-tumor immunity

Heng Yina,1, Meng Liua,1, Yaling Zhaoa,1, Haitao Wub, Danna Zhengc, Zhenhui Guoa, Ying Zhoua, Shaofeng Wua, Chuanbing Chend, Lei Zhangd, Shanshan Songe,*, Yanli Hef,*, Ren Zhanga,*

a Research Centre of Basic Integrative Medicine, School of Basic Medical Sciences, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, China

b Science and Technology Innovation Center, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, China

c The First Affiliated Hospital of Jinan University, Guangzhou 510006, China

d School of Pharmaceutical Sciences, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, China

e Integrated Hospital of Traditional Chinese Medicine, Southern Medical University, Guangzhou 510315, China

f Department of Pathology and Pathophysiology, School of Basic Medical Sciences, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, China

1 Both authors contributed equally.

*Corresponding author.

Abstract

Lycii Radicis Cortex (LRC) is a medicinal and food homologous plant with various pharmacological activities, including anti-tumor effects. This study explores the anti-tumor effect of LRC on non-small cell lung cancer (NSCLC) and its molecular mechanism using mice bearing Lewis lung carcinoma cells. LRC significantly suppressed the growth of NSCLC. Besides, RNA sequencing of mice tumors and hematoxylin & eosin and immunofluorescence staining revealed that LRC promoted the infiltration of T lymphocytes, specifically GZMB+CD8+T lymphocytes, in tumor tissues. The Gene Set Enrichment Analysis of spleen RNA indicated that LRC up-regulated PD-1-downstream pathways, suggesting that LRC exerted its effects through the PD-L1/PD-1 pathway. Further experiments revealed that LRC interacted with PD-L1, blocking PD-L1/PD-1 binding and thus restoring the T cell killing activity on tumor cells. Together, these results support using LRC as healthy food to improve anti-tumor immunity in patients with NSCLC.

Reference:

YIN H, LIU M, ZHAO Y L, et al.

Lycii Radicis Cortex

本文编译内容由作者提供

编辑：梁安琪；责任编辑：孙勇

封面图片：图虫创意