siRNA转染实验操作要点

siRNA 转染实验是以 siRNA 分子为核心干预因子，通过物理、化学或生物介导的方法，将外源性 siRNA 高效递送至靶细胞内的实验技术体系。其核心流程涉及细胞培养、siRNA 序列设计与合成、转染试剂选型、转染条件优化及后续对mRNA及蛋白表达水平的沉默效果验证。

一、前期细胞培养与准备

前期细胞培养是 siRNA 转染实验成功的基础，需保障被转染细胞处于对数生长期，可以说细胞状态直接决定转染效率与实验成败。该阶段主要包含细胞复苏、传代与转染前铺板三个关键步骤：细胞复苏与传代需经冻存细胞解冻、培养基处理、离心重悬及接种培养，待细胞达适宜融合度后进行消化传代；转染前铺板需在转染前 1 天完成，经细胞消化计数后按对应密度铺于指定培养板。同时要注意根据转染试剂类型调整铺板密度，如阳离子脂质体类siRNA 转染试剂要求细胞密度为70%-90%，在铺板时可选择60%密度进行铺板。像RNAiMAX和RFect等，要求细胞密度在30%-50%，则可选择20%-25% 的密度进行铺板，最终密度还需结合细胞实际状态与增殖速度灵活调整。

二、siRNA设计与合成

siRNA的序列设计应精准靶向目标基因关键区域，规避非靶向干扰，同时通过设置对照序列保障实验结果的可靠性。在设计层面，siRNA 序列需靶向目标基因的CDS 区或3' UTR等关键区域，且需避免连续 4 个相同碱基、发夹结构及与非靶基因同源序列，以降低非靶向干扰风险；在对照设置层面，需设计阴性对照（无关序列 siRNA）和阳性对照（已知高效沉默的 siRNA），为实验结果质控提供依据。

考虑到 siRNA 序列筛选的复杂性与靶向效率的不确定性，科研实践中多数研究者倾向于选择生物公司提供的 “三保一” 合成服务套餐。该套餐包含三条目的基因siRNA的序列，并保证至少有一条siRNA序列对目的基因mRNA具有显著的降解作用，同时包括阳性对照siRNA和阴性对照siRNA，可以满足绝大多数研究者的实验需求。目前，苏州瑞博、常州百代、金斯瑞等专业生物公司均已推出此类成熟服务，为科研工作者提供了高效便捷的选择。

三、siRNA的转染

siRNA 转染是依托 RNA 干扰机制实现基因精准沉默的关键实验环节，其效率与稳定性直接取决于转染试剂的性能。转染试剂性能主要通过转染效率、细胞毒性及操作便捷性三个维度评估。

在性能评价维度上，转染效率包含 siRNA 转染阳性率和基因沉默率。转染阳性率可以通过荧光显微镜观察评估，基因沉默率需通过RT-qPCR 在mRNA 水平检测。细胞毒性直接关系到细胞活性与实验结果真实性，高毒性会导致存活细胞数量不足，影响RNA提取和蛋白提取的样本量，同时可能改变细胞正常生理状态，造成实验结果失真。操作便捷性则影响实验耗时、人为误差与结果重复性，若操作繁琐则易延长试验周期，增加误差风险，降低实验重复性。

从试剂类型来看，主流产品分为阳离子脂质体类与生物纳米材料类。阳离子脂质体类转染试剂通过自身正电荷与带负电的 siRNA 结合，形成复合物后穿透细胞膜，实现 siRNA的高效递送。以赛默飞 RNAiMAX 为代表的这类试剂，凭借成熟的脂质体递送技术，在多种常规贴壁细胞中能实现较高的转染效率，是不少基础科研实验的常用选择，但存在细胞的毒性较高和操作繁琐的局限。使用这类试剂转染后细胞死亡率约10% ，可能改变细胞生理状态；另一方面，转染前需用 Opti-MEM 等无血清培养基稀释试剂与 siRNA，转染后 6 小时内及时更换为含血清完全培养基，增大了额外的操作步骤，影响实验重复性。

除阳离子脂质体外，以生物纳米材料为核心的 siRNA 转染试剂，正凭借独特优势获得更多青睐。这类试剂依托可降解生物纳米材料的特性，能有效降低细胞的毒性，同时大幅简化操作流程，已逐渐成为科研人员的优选。其中，百代生物的 RFect 小核酸转染试剂是典型代表。作为国内最早开始研发小核酸递送技术的生物公司之一，RFect依托国内与国际双重发明专利技术，构建了高效且普适性强的递送体系。其转染效率在Hela、293t、A549、MCF-7等常见贴壁细胞中可与RNAiMAX媲美，在部分难转的细胞中甚至更具优势。此外，RFect细胞毒性显著更低，转染后细胞死亡率约5%，与正常细胞培养状态下的自然死亡率基本一致；且转染 6 小时后无需额外换液，省去繁琐操作步骤，能降低人为误差风险，提升实验重复性。

四、RT-qPCR检测siRNA敲降效果

RT-qPCR检测 siRNA 的敲降效率最常用的技术手段，能从mRNA 水平精准量化目标基因的表达变化，其检测流程需围绕 RNA 提取与反应体系选择展开，以保障结果准确性。

在检测时间上，RT-qPCR通常在 siRNA 转染后 48 小时进行，具体时间选择可根据细胞类型灵活调整。在RNA提取环节，相较于传统的 Trizol 法，试剂盒法对操作者的熟练度要求更低，通过预封装的离心柱与优化缓冲液简化操作步骤，减少人为误差，更适合批量样本提取或新手操作。实验室常用的品牌包括赛默飞、BIOG、Qiagen等等。在反应体系选择上，RT-qPCR分为一步法和两步法，适用于不同实验场景与操作人员。两步法的可保留中间产物cDNA，便于灵活调整用量与稀释比例，适合对实验条件有较高调控需求的场景，但存在样本污染风险且对操作规范性要求稍高；一步法则是将逆转录与qPCR 整合于同一反应管，通过预混体系减少操作步骤与污染风险，简化实验流程，对试剂盒的选择可以从适配性和性价比方面进行综合考量。

五、Western Blot验证蛋白合成

Western Blot（WB）是确认 siRNA 沉默效果的最终验证手段，可从蛋白层面弥补 mRNA 水平检测不足，其实验结果的准确性与重复性取决于关键步骤的操作把控与试剂选型。WB核心流程围绕 “蛋白提取与处理→分离→转移→特异性结合→显影分析” 展开，主要包括样品制备、蛋白定量、SDS-PAGE 电泳、转膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育、ECL 显影这 8 个关键步骤。

1、样品制备

样品制备即细胞总蛋白提取，目的是从转染后细胞中获取完整、未降解的总蛋白并去除培养基残留、细胞碎片等杂质。蛋白提取要注意全程应在冰上或 4℃进行，裂解液中添加新鲜蛋白酶抑制剂。这一步涉及RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂等试剂选择，需根据目标蛋白类型（如常规蛋白、磷酸化蛋白）与细胞类型（如贴壁细胞、悬浮细胞）综合判断。

2、蛋白定量

蛋白定量目的是测定蛋白浓度，确保后续上样量一致，避免条带亮度偏差。目前蛋白定量优先选 BCA 法，常用的是Thermo Fisher BCA 定量试剂盒。

3、SDS-PAGE 电泳

SDS-PAGE 电泳通过凝胶分子筛效应，将不同分子量蛋白按大小分离，为转膜做准备。操作时需根据目标蛋白分子量选分离胶浓度，按照说明书要求进行实验。关于PAGE胶的选择，实验人员可以根据自身需要选择不同类型的产品，不同公司提供的产品形态各有差异：武汉赛维尔等公司仅提供干粉，使用时需实验人员额外配制缓冲液；碧云天等公司则会在试剂盒内预先配好缓冲液，能减少实验人员的准备步骤；BIOG、雅酶等公司更便捷，直接提供配好的溶液，开箱后可直接使用。

4、转膜

转膜需要这一步需按 “负极→海绵→滤纸→凝胶→膜→滤纸→海绵→正极” 组装三明治，用以排除气泡。在实验过程中，我们要根据蛋白大小来选择合适孔径的PVDF膜，大于20kDa的蛋白建议选用0.45um的膜，小于20kDa的蛋白建议选用0.22um的膜。

5、封闭

封闭是用液阻断膜上未结合蛋白的位点，减少后续抗体非特异性结合，降低背景信号。封闭需根据蛋白类型选择封闭液，常规蛋白常用 5% 脱脂牛奶，而检测磷酸化蛋白时，因脱脂牛奶中含与磷酸化蛋白成分相近的杂质，可能干扰抗体结合，常用 5% BSA进行封闭，避免非特异性结合与蛋白去磷酸化。此外，还可选择 BIOG 的无蛋白快速化学封闭液，不仅可充分封闭PVDF膜和NC膜上的非特异性抗体结合位点，还大大有利于特异性抗原位点的暴露，促进抗原抗体的特异性结合，显著提升免疫检测的灵敏度。

6、一抗孵育

封闭过后就来到了一抗孵育，这是 WB 检测特异性的关键一步，其目的是让特异性一抗与膜上目标蛋白结合。操作时需按抗体说明书比例进行适度稀释，避免一抗浓度过高导致背景高，过低导致信号弱的情况。实验时需结合检测目标类型、实验精度要求及预算成本进行综合判断，优先选择有 WB 实验验证数据的一抗，像Abcam/CST、Proteintech、santa cruz等都可以纳入选择考量范围。

7、二抗孵育

二抗孵育其核心目的是通过识别一抗的种属来源（如兔源、鼠源），让 HRP（辣根过氧化物酶）标记的二抗结合到一抗上，实现信号放大，同时为后续 ECL 显影提供酶促反应的 “信号载体”。二抗孵育需严格匹配一抗种属，标记类型优先选 HRP，避免种属交叉反应。

8、ECL显影

ECL显影是通过 HRP 与 ECL 试剂中的化学发光底物反应，产生可被检测的光信号，将膜上的蛋白-抗体复合物转化为可视化条带，最终通过信号采集与灰度分析，判断目标蛋白的表达量变化，即 siRNA 的蛋白水平沉默效果。

在选择ECL检测试剂时需结合目标蛋白的表达量、显影设备、实验成本，优先选择信号稳定、发光持续时间长的试剂，如Thermo Fisher、常州百代、南京凯基等等。

WB 作为 siRNA 沉默效果的 “最终验证环节”，可从蛋白层面确证基因沉默成效并弥补 mRNA 检测局限，其操作细节与试剂选型对结果至关重要，需同步强化把控。

siRNA 转染实验有着 “环环相扣、细节决胜” 的特点，从细胞培养到siRNA 设计合成、转染试剂筛选，再到后期 RT-qPCR 检测与 WB 验证，各环节紧密关联、相互影响。优质试剂的选用能显著降低实验操作难度、提升重复性结果，而严格遵循各步骤操作标准则是规避认为误差的核心前提，实验过程中只有全程把控每一个细节的科学性与合理性，才能让这一基因调控工具真正发挥其在科研与应用中的核心价值。