AbMole小课堂 | 如何用H2DCFDA精准检测细胞氧化应激？

活性氧（ROS）在细胞的生命活动中扮演着极为重要的角色，涉及到细胞的衰老、死亡、癌变。对ROS的检测是许多课题中的关键实验之一。H2DCFDA（DCFH-DA，AbMoel，M9096）是一款灵敏的ROS探针，为科研工作者提供了重要的研究工具。

一、H2DCFDA（DCFH-DA）的机理

H2DCFDA（2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯，AbMole，M9096）是一种常用的活性氧（ROS）荧光探针，广泛应用于细胞生物学、生物化学和分子生物学等领域的研究。H2DCFDA是一种细胞渗透性指示剂，在细胞内的酯酶作用下，其乙酸基团被去除，产物为H2DCF。此时处于非荧光状态，并且无法再通过细胞膜。当细胞内存在氧化环境时，H2DCF会被氧化为发绿色荧光的2,7-二氯二氢荧光素（DCF，EX/EM = 488/525 nm），从而可用于检测细胞内ROS的水平。

图 1. H2DCFDA检测ROS的原理

二、H₂DCFDA（DCFH-DA）的研究应用

H₂DCFDA（DCFH-DA，AbMole，M9096）作为一种细胞渗透性探针，能够有效检测细胞内的氧化应激和ROS水平。H₂DCFDA可以检测过氧化氢（H₂O₂）、超氧阴离子（O2⁻）、羟基自由基（·OH）和过氧亚硝酸盐（ONOO⁻）等ROS。一般可将细胞与H2DCFDA（多数情况下浓度为10 µM）孵育30分钟，然后用流式细胞术或者荧光显微镜进检测。注意染色过程中要使用无血清的培养基，以免影响检测结果。

近年来，铁死亡（Ferroptosis）研究取得了显著进展，H₂DCFDA作为检测工具在其中发挥了重要作用。通过检测细胞内的ROS水平，并结合ABDP 581/591 C11（AbMoel，M29325）进行脂质过氧化检测，以及CCK-8（AbMole，M4839）等进行细胞活力分析，可以分析细胞死亡的主要原因和类型。

三、范例详解

1.Sci Adv. 2024 Aug 16;10(33):eado7249.

苏州大学第一附属医院的研究人员设计了一种水凝胶（FDA-TA），它可通过重塑铁代谢来修复组织。FDA-TA可以吸附胞外的铁离子，以调节铁代谢并抑制铁死亡，进而促进组织修复。研究者构建了大鼠尾椎穿刺模型，来评估FDA-TA对椎间盘退行性病变（IVDD）的抑制效果。实验人员在探究铁离子（Fe3+）能否引起细胞氧化应激和铁死亡的实验中，使用了AbMole的H₂DCFDA（DCFH-DA，AbMole，M9096）和JC-1（AbMole，M9724），它们分别被用于检测活性氧（ROS）的生成和线粒体膜电位的变化[1]。

图 2. Fe3+可以诱导细胞氧化应激和线粒体膜电位异常[1]

2.Plant Biotechnol J. 2023 May;21(5):943-960.

兰州大学、宁夏医科大学的研究者们在上述论文中研究了C2H2型锌指转录因子OSIC1在杨树中对渗透胁迫下气孔关闭的正向调控作用。研究发现，OSIC1在盐、干旱、聚乙二醇6000（PEG6000）和脱落酸（M7597，ABA）诱导下表达上调。过表达OSIC1的转基因杨树在上述处理条件下表现出更强的耐受性，这主要是通过减少气孔开度来实现的。而通过CRISPR/Cas9系统产生的OSIC1突变体则表现出相反的表型。此外，OSIC1能够直接上调PalCuAOζ的表达，该基因编码一种含铜多胺氧化酶，可增强保卫细胞（guard cells，负责储存淀粉调节渗透压的细胞）的过氧化氢积累，从而在环境压力发生时调节气孔关闭。在这项研究中，AbMole的H2DCFDA（DCFH-DA，AbMole，M9096）被用来检测杨树保卫细胞在不同处理条件下的H₂O₂积累情况[2]。

图 3. Detection of H2O2in guard cells under different treatments[2].

3.Mater Today Bio. 2023 Jun 24;21:100711.

苏州大学第一附属医院的研究者们在上述文章中研发了一种以黑色素为原型的微囊（BHB-PDA-MCs），用于肝纤维化（HF）的抑制。BHB-PDA-MCs的核心为水相，外壳由聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）和聚多巴胺纳米颗粒（PDANPs）组成。PDANPs是天然黑色素的合成类似物，具有抗氧化特性。而微囊的核心用于封装酮体β-羟基丁酸（BHB），这是一种已知的免疫代谢调节剂，能够抑制NLRP3炎症体的激活。在体外实验中，PDANPs能够减轻H2O2诱导的肝细胞（LO2细胞）和肝星状细胞（HSC-T6细胞）的氧化水平，而BHB能够减少巨噬细胞（Raw264.7细胞）产生的促炎和促纤维化因子；在CCl4诱导的肝纤维化小鼠模型中，研究者发现BHB-PDA-MCs能够抑制HSCs的激活，减少ECM蛋白的沉积，减轻肝小叶的损伤，并保护肝功能。在这项研究中，AbMole的H2DCFDA（DCFH-DA，AbMole，M9096）被用来检测LO2和HSC-T6细胞在H2O2刺激下的氧化水平和微囊系统的保护作用。

图 4. Fluorescent images showing the ROS levels in LO2 or HSC-T6 cells after co-cultured with blank control, H2O2, or PDA-MCs[3]

参考文献

[1] Y. Xu, F. Cai, Y. Zhou, et al., Magnetically attracting hydrogel reshapes iron metabolism for tissue repair, Science advances 10(33) (2024) eado7249.

[2] Q. Bai, Z. Niu, Q. Chen, et al., The C(2) H(2) -type zinc finger transcription factor OSIC1 positively regulates stomatal closure under osmotic stress in poplar, Plant biotechnology journal 21(5) (2023) 943-960.

[3] X. Zhao, Z. Fan, C. Zhu, et al., Melanin inspired microcapsules delivering immune metabolites for hepatic fibrosis management, Materials today. Bio 21 (2023) 100711.