Cell Genomics丨F. rodentium Cas9的结构和功能基础为 CRISPR-Cas 蛋白质工...

CRISPR-Cas9 基因编辑技术虽已革新生物医学研究，但临床转化仍受限于脱靶效应与 PAM 序列限制两大核心挑战 —— 目前广泛使用的 SpCas9 需识别 “NGG” PAM 序列，难以靶向基因组中大量 AT 富集区域（如调控基因转录的启动子 TATA 盒），且脱靶风险较高【1, 2】。而源自啮齿类粪杆菌（Faecalibaculum rodentium）的 FrCas9，此前已被发现具有更高的编辑保真度与 AT 区域靶向优势【3-5】，但其分子机制长期未明。

近日，胡争教授团队在Cell Genomics期刊发表题为Structural and functional bases ofF.rodentiumCas9 provide insights into CRISPR-Cas protein engineering的研究，该团队通过冷冻电镜（cryo-EM）解析FrCas9的关键构象，揭示其高保真编辑的结构基础，并基于此开发出超精准变体eFrCas9，在杜氏肌营养不良症（DMD）的基因治疗中展现出优异潜力，为下一代CRISPR工具的理性设计提供了分子蓝图。

研究团队首先通过 cryo-EM 技术，解析了 FrCas9-sgRNA-DNA 三元复合物的 R 环扩展状态（RE complex，2.89 Å 分辨率）与预催化状态（PreC complex，3.46 Å 分辨率）结构，这是首次在原子水平上揭示 FrCas9 的动态工作过程。在 RE 状态下，FrCas9 已识别 PAM 序列并启动 DNA 解旋，形成 15 bp 的 sgRNA-DNA 异源双链与 8 nt 的种子区，但异源双链仍锚定在 REC2 与 REC3 结构域之间，不同于 SpCas9 沿 REC3-HNH 结构域沟槽延伸的模式，提示其 R 环扩展机制具有独特性；而进入 PreC 状态后，复合物进入切割前的准备阶段，异源双链在 8-9 bp 与 15-16 bp 处出现超螺旋结构特性，这种结构使 FrCas9 能在与 SpCas9 相近的长度内容纳 22 bp 的间隔序列（SpCas9 通常为 20 bp），同时压缩 DNA 主沟至 15.5-15.7 Å，显著降低对错配碱基的容忍度，这正是其高保真的核心结构基础。

与 SpCas9 识别 GC-rich 的 “NGG” PAM 不同，FrCas9 通过 PI 结构域（PAM-interaction domain）特异性结合 5'-NRTA-3' PAM（R 为 A/G），这一特性使其能高效靶向启动子 TATA 盒等 AT 富集区域。研究通过结构分析与突变验证，明确了关键识别机制：PAM 序列的 + 1 位 T（dT1*）通过磷酸骨架与 Y1198 形成氢键；+2 位嘌呤（A/G）通过 N1137 的氢键识别，若为嘧啶则无法形成有效作用；+3 位 T（dT3*）通过 K1321 的水介导氢键结合；+4 位 A（dA4*）则与 Q1334 形成双齿氢键。当关键识别残基（如 N1137、Y1198）突变为丙氨酸后，FrCas9 的 PAM 结合能力与编辑效率显著下降，且对 + 2 位嘧啶的识别完全丧失，进一步证实了该作用模式的特异性。

研究团队进一步聚焦 FrCas9 的磷酸盐锁环（PLL，D1101-V1103），这一区域是调控 DNA 结合与切割效率的关键元件。通过饱和突变筛选与功能验证，发现 PLL 区域的 V1103 位点存在电子密度空腔，替换为赖氨酸（V1103K）后，其正电荷侧链能更紧密结合 DNA minor groove。GUIDE-seq 分析显示，V1103K 突变体的 on-target 效率比野生型 FrCas9 提升 1.2 倍，off-target 事件却减少 30.15%，且在 9 个靶位点中均未检测到显著脱靶。将 V1103K 与 PAM 远端区域的 N732A 突变结合（命名为 eFrCas9），可进一步增强异源双链识别的特异性。

DMD 的主要致病原因是 dystrophin 基因外显子缺失，其中外显子 45-55 的缺失占患者总数的 60%，精准删除该片段是潜在治愈策略6。研究团队在人骨骼肌成肌细胞（HsKMM）中验证 eFrCas9 的治疗潜力，通过成对 sgRNA 靶向 intron44 与 intron55，eFrCas9 可实现 43.6-62.1 kb 片段的精准删除，其中精确删除效率最高达 17.25%（无indel），若计入含少量 indel 的有效删除，总效率达 43.91%。相比之下，SpCas9 的精确删除效率为 0，含 indel 的删除效率仅 19.21%，且伴随大量 off-target 事件（每 sgRNA 平均 3.2 个脱靶位点）；而 eFrCas9 在 10 个 sgRNA 中，有 5 个未检测到脱靶，剩余 5 个仅 1 个脱靶位点，安全性显著提升。

该研究通过结构解析揭示了 FrCas9 高保真、宽靶向的分子基础，其发现的 “PLL 工程化 + PAM 远端优化” 策略为 CRISPR 工具的理性设计提供了通用范式。而 eFrCas9 在 DMD 治疗中的优异表现，不仅证实了其临床转化潜力，更为遗传疾病的精准基因编辑开辟了新路径 —— 未来有望结合碱基编辑、引导编辑等技术，进一步拓展其在肿瘤治疗、表观调控等领域的应用。

原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2666979X25002952

制版人：十一

参考文献

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4.Wang, H., Ding, J., Zhu, J., Liu, X., Xu, R., Qin, R., Gu, D., Li, M., Wei, P., and Li, J. (2024). Developing a CRISPR/FrCas9 system for core promoter editing in rice.aBIOTECH.https://doi.org/10.1007/s42994-024-00157-5.

5.Tian, R., Tian, X., Yang, M., Song, Y., Zhao, T., Zhong, C., Zhu, W., Zhou, P., Han, Z., and Hu, Z. (2025). Systematic high-throughput evaluation reveals FrCas9’s superior specificity and efficiency for therapeutic genome editing.Sci. Adv. 11, eadu7334. https://doi.org/10.1126/sciadv.adu7334.

6.Young, C.S., Hicks, M.R., Ermolova, N.V., Nakano, H., Jan, M., Younesi, S., Karumbayaram, S., Kumagai-Cresse, C., Wang, D., Zack, J.A., et al. (2016). A Single CRISPR-Cas9 Deletion Strategy that Targets the Majority of DMD Patients Restores Dystrophin Function in hiPSC-Derived Muscle Cells.Cell Stem Cell18, 533–540. https://doi.org/10.1016/j.stem.2016.01.021.

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