AAV基因治疗产品相关动物种属选择的一些考量

基因治疗药物（Gene Therapy Medicinal Products, GTMPs）的定义：GTMPs是一种包含遗传物质的载体或递送系统，旨在通过表达特定的基因来修复、调节、替换、添加或删除遗传序列。腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）载体因其理化性质稳定、低免疫原性、致病性弱、整合风险低、目的基因表达持久等结构和生物学方面的优势，成为体内基因治疗应用最广泛的载体之一。目前已有至少6种AAV基因治疗药物获EMA/FDA批准上市，包括Luxturna、Zolgensma、Glybera、Roctavian、Upstaza和Hemgenix。

众所周知，非临床研究数据对于支持临床试验的启动和后续的药品上市许可申请至关重要。非临床研究中，选择合适的动物种属对于数据的临床有效转化也非常关键。本文讨论下AAV基因治疗产品选择非临床动物模型的关键考量因素。

AAV属于细小病毒科，具有约4.7 kb的单链DNA基因组。目前已鉴定出13种AAV血清型，超过100种变体。通过替换AAV的Rep（复制）和Cap（衣壳）基因，可以将其改造为有效的基因治疗载体。当然，AAV作为基因治疗载体也有一定的风险，比如人体中普遍存在针对AAV的抗体，可能导致免疫原性问题。高达60%的人群在自然暴露后会产生抗AAV的中和抗体，这些抗体可以阻止AAV载体与细胞受体结合，从而降低基因治疗的效果。而且，重复给药可能导致更强烈的免疫反应，故AAV基因治疗多为单次给药。另外，AAV能趋向多种组织，可能导致转基因在非靶组织表达，进而引发毒性。在非人灵长类动物和小型猪中，AAV给药被发现可能导致背根神经节的毒性。高剂量AAV还可能导致严重的肝毒性、心肌炎等不良反应。近年来，研究人员通过多种策略解决这些问题，比较常见的是改造AAV的Cap基因，因为病毒衣壳对细胞/组织趋向性至关重要，同时也是先天和适应性免疫反应的识别位点。另外一种降低免疫反应的策略是改变给药途经。眼睛、大脑、中枢神经系统、睾丸和子宫等部位被认为是免疫豁免区域，这些部位对AAV基因治疗的免疫反应较弱。例如，Luxturna（AAV2基因治疗）通过视网膜下注射给药，临床试验中仅观察到轻微的免疫反应，且未发现显著的免疫原性。当然，非病毒载体技术的进步也是潜在解决AAV载体免疫原性、毒性、高成本的路径之一，比如研究较多的脂质纳米颗粒（LNPs）递送。

一提到病毒，很多人比较担心其传染风险，甚至遗传风险。AAV载体有复制缺陷，通过水平传播（如人与人之间传播）的可能性极低。尽管在人类精液样本和小鼠睾丸中检测到AAV载体，但未在生殖细胞中检测到，且没有通过生殖系传递给后代的证据。在临床试验中（如Glybera治疗），也未观察到生殖系遗传的证据。另外，AAV载体在目标细胞核内以游离形式存在，整合率极低（0.1%-1%）。在FDA细胞、组织和基因治疗咨询委员会的会议上，讨论了AAV载体的潜在安全性问题，特别是关于小鼠接受AAV治疗后发展为肝细胞癌（HCC）的报告。目前，尚未在患者中观察到与AAV载体相关的肿瘤发生事件。故，AAV载体的整体安全性其实并无太多担忧。

AAV载体基因治疗的临床前/临床转化

AAV基因治疗从基础研究转化为临床试验的过程中，选择合适的动物种属是关键，选择动物种属时可以从4个方面考虑：1）确认受试物在选定动物种属中的药理学活性；2）确认动物对AAV类型的易感性，即所选AAV可以感染该种属；3）确认AAV的细胞/组织趋向性：确保AAV载体在动物中能够靶向预期的细胞或组织；4）选择的动物模型的生理特征应与人类相似，以更好地模拟临床情况。如下图所示。

药理学活性比较容易理解，不只针对AAV基因治疗，也适用于其它药物形式的种属选择。需要确认目的基因在动物模型中的效力与人体相当。动物表达与人体相同的受体/表位/抗原。药理学活性的确认可以通过体外或体内试验方法确认。根据EMA指南（Guideline on the quality, non-clinical and clinical aspects of gene therapy medicinal products），对于基因治疗药物（GTMPs）的新型AAV基因治疗，非临床安全性研究可以仅在一个动物种属中开展。这点与传统的化药和生物药的双种属要求不同。如果所选择的动物模型不能充分反映临床风险，则需要多个动物种属交叉确认。不过，NMPA《腺相关病毒载体基因治疗产品的非临床研究技术指导原则》建议应获得两种相关动物种属（啮齿+非啮齿）的非临床安全性信息，若仅采用一种相关动物，需要提供科学合理的依据。已上市的6款AAV基因治疗药物重复给药毒性试验所用种属分别为，Luxturna（犬、猴）、Zolgensma（小鼠）、Roctavian（小鼠、猴）、Upstaza（GLP大鼠，non-GLP猴）、HEMGENIX（小鼠、猴）、Glybera（小鼠）。

如果无药理学相关动物模型，可以考虑采用在动物中有药理学活性的替代分子开展研究，比如CD19-CAR T产品Yescarta和 Tecartus。除以上外，NMPA提醒在动物筛选及分组时需关注预存抗体及其对体内药物暴露的可能影响，尽量选择预存抗体阴性的动物用于试验。

确认AAV载体在选定的动物种属中是否可感染是相关动物种属选择的另一个关键因素。AAV载体必须能够绕过宿主免疫系统，并在动物和人体中以类似的方式发挥作用。如果AAV载体在选定的非临床动物种属中不被接受，即不具备感染可能，也就不宜作为相关种属开展后续研究。

除了感染敏感性，AAV载体是否对非临床动物种属和人体的细胞/组织具有趋向性，也是相关种属选择的重要依据之一。感染敏感性、细胞/组织趋向性可以通过查阅文献初步确定，再通过体外和/或体内试验进一步确证。常见AAV血清型不同种属组织趋向性特点如下表所示。

啮齿类动物是可以用于AAV基因治疗的关键非临床安全性研究的。不过，如果从小动物到人体的数据转化存在挑战，则可能需要使用大型动物模型（如小型猪、犬或非人灵长类动物）。比如，解剖学差异可能限制某些给药途径的操作实施。另外，由于对背根神经节（DRG）毒性的担忧，考虑到非人灵长类在AAV给药后表现出与人类相似的DRG毒性，这类动物也可以考虑，且监管机构认可。选择的非临床动物种属与人类之间的生理差异也必须考虑，以确保动物生成的数据能够准确转化为人体。

另外，通过广泛的文献分析发现，AAV基因治疗产品最常用的种属是小鼠，其次是大鼠，如下表所示（I.V. Intravenous, I.C. Intracardiac, I.Per. Intrapericardial, I.Cor. Intracoronary, I.M.Intramuscular, I.Vit. Intravitreal, Sub.Ret Subretinal, S.C. Subcutaneous.）。大小鼠常用的原因是繁殖速度快、易于饲养和操作，且能够进行遗传操作，产生新的转基因品系。此外，现有的近交系特征明确，涵盖免疫功能正常和免疫缺陷的品系，且有大量商业化试剂可用。近年来，人源化小鼠模型也被用于AAV基因治疗药物的开发。这些模型在目标基因在所选动物中不表达时具有优势，但使用这些模型也存在挑战，比如模型复杂，难以按照GLP要求进行操作，且可能难以区分安全性和有效性问题。

在非临床研究中，犬类（尤其是比格犬）曾是AAV基因治疗最常用的非临床研究大动物种属，例如Luxturna。然而，近年来由于伦理问题，犬作为首选大型动物模型的地位受到质疑，小型猪的使用在逐渐增加。小型猪因其生理和解剖结构与人类相似，已成为标准的毒理学模型之一。其中，哥廷根小型猪（Göttingen Minipig）因其基因组特征明确、历史背景数据丰富而备受关注，尽管这些历史数据主要来自小分子药物研究。哥廷根小型猪在AAV基因治疗研究中也得到了广泛应用，例如用于靶向肝脏的AAV研究、针对亨廷顿病的AAV-miHTT基因治疗，以及FDA批准的AAV基因治疗药物Zolgensma的非临床研究。

非人灵长类动物因其与人类在进化关系、生理和药理学方面高度相似，也是AAV基因治疗药物非临床研究的选择之一。然而，由于伦理问题，使用非人灵长类动物的前提是，受试物在其他毒理学常用种属中无药理活性。非人灵长类动物被用于Luxturna和Zolgensma等药物的非临床研究。

以上基本是从AAV，也就是病毒载体的角度，思考如何选择合适的种属。除此以外，AAV携带的目的基因也要纳入考量。这点，NMPA在其指导原则里面有清晰描述，动物相关种属选择需考虑动物对AAV载体携带的目的基因的转录和/或表达可行性及其表达产物的生物学效应与预期的人体效应的相似性。这点比较常规，不再展开，可以借鉴生物药的一些思路。

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