J. Future Foods | 采用阴离子交换树脂-超滤-pHPLC联用技术从炒萝卜籽中制备萝卜苷并探究其抗高血脂活性

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Introduction

高脂血症是一种常见的慢性心血管疾病，其特征是总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）异常升高，而高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）下降，是动脉粥样硬化、高血压和冠心病等心血管疾病的重要诱因之一。目前临床治疗高脂血症的药物虽有效，但多数存在恶心、腹痛、肝酶升高等副作用。因此，从植物源功能食品中寻找安全有效的降脂药物成为重要替代策略。

硫代葡萄糖苷（glucosinolates，GLs）是一类含氮和硫的次生代谢物，主要存在于十字花科植物中，其核心结构包含

D

Raphanus sativus

本研究通过静态吸附和解吸实验筛选最佳树脂，进一步通过动态吸附和解吸实验优化上样条件（样品pH、浓度、流速、树脂直径高度比、上样体积）和洗脱条件（洗脱液浓度、流速、体积），利用超滤和pHPLC去除NaCl并纯化GRE，通过HPLC测定纯度，采用HPLC-飞行时间质谱（HPLC-TOF-MS）和核磁共振（NMR）对GRE的分子质量和结构进行表征。最后，通过观察高脂血症小鼠灌胃不同剂量GRE后的体质量、血清及肝组织中TG、TC、HDL-C、LDL-C、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、载脂蛋白A（Apo-A）、载脂蛋白B（Apo-B）水平变化及肝组织病理变化，评估GRE的抗高脂血症活性。

图1 GRA（a）和GRE（b）的结构

Results

HPLC方法验证

由GRE标准溶液和 SSR 样品溶液的色谱图可知，GRE色谱峰分离良好，无其他化合物干扰（图2）。结果表明， 该 HPLC 方法适用于SSR中 GRE 的定量分析。

化合物1，GRE。

图2 GRE标准溶液（a）和SSr样品溶液（b）的色谱图

阴离子交换树脂筛选

6 种阴离子交换树脂对GRE的吸附和解吸能力结果显示（图3），D201-OH⁻树脂解吸率最低，无法有效解吸GRE；D315-OH⁻和D315-Cl⁻树脂虽解吸率较高，但吸附率低，不能有效吸附GRE。与D301-OH⁻树脂相比，D301-Cl⁻树脂的静态吸附率和解吸率更高；与D201-Cl⁻树脂相比，D301-Cl⁻树脂静态吸附率略低，但解吸率更高。综合表明，D301-Cl⁻阴离子交换树脂最适合分离GRE。

图3不同阴离子交换树脂的静态吸收率和解吸率

动态吸附与解吸条件优化

上样条件：样品pH值对D301-Cl⁻树脂吸附GRE的能力无显著影响，选择原溶液pH=6进行实验（图4a）。样品浓度为0.10g/mL时吸附量（AC）适中，且高于0.15g/mL时AC未显著增加，故选择0.10 g/mL（图4b）。当样品流速大于2 BV/h时，AC呈下降趋势，确定流速为2 BV/h（图4c）。树脂柱直径高度比（1:4～1:12）对AC影响较小，选择1:8（图4d）。突破曲线显示，当上样体积超过7BV时，突破率超过10%，因此最佳上样体积为7 BV（图5）。

图4 样品pH值对AC的影响（a）、样品浓度对AC的影响（b）、吸附流量对AC的影响（c）、直径高度比对交流电的影响（d）

图5 穿透曲线随样品体积的变化

洗脱条件：NaCl为 5 g/100 mL时洗脱率最高，选为洗脱液（图6a）。洗脱流速为2 BV/h时洗脱率最高，确定此流速（图6b）。当洗脱体积超过4 BV时，洗脱率保持恒定，表明GRE已完全洗脱，最佳洗脱体积为4 BV（图 6c）。

图6 NaCl浓度对GRE洗脱速率的影响（a）、(b)洗脱流速对GRE洗脱速率的影响（b）、洗脱液体积对GRE洗脱速率的影响（c）

GRE的纯化与纯度测定

超滤后的粗GRE仍含杂质，经pHPLC纯化并冻干后，HPLC面积归一化法测得纯度为95.1%（图7、8）。

图7 GRE的pHPLC纯化

图8 GRE的HPLC面积归一化法分析

结构鉴定

分子质量测定：HPLC-TOF-MS 在负离子模式下检测到GRE的 [M-H]⁻离子峰为m/z 434.025 9，与计算分子质量（m/z 434.024 9）一致（图9）。

图9 GRE的分子质量

核磁共振分析：¹H和 ¹³C NMR谱图数据与文献报道的GRE NMR数据一致，进一步确认其结构（图10）。

图10GRE的1H-NMR谱（a）和13C-NMR谱（b）

抗高脂血症活性评估

体质量变化：模型组小鼠体质量增长显著高于对照组，中、高剂量GRE组（mGRE、hGRE）和辛伐他汀（SV）组体质量增长显著低于模型组结果表明中、高剂量GRE可抑制高脂饮食小鼠体质量增加（图11）。

与对照组相比，*

P

P

图11 给药期间小鼠体质量（a）和体质量变化（b）

脏器系数与形态：模型组肝系数显著高于对照组，mGRE、hGRE和SV组肝系数显著低于模型组，肾脏系数各组无显著差异。模型组肝脏表面粗糙，mGRE和hGRE组肝脏形态接近对照组，肾脏形态无明显差异（图12、13）。

图12肝脏（a）和肾脏（b）系数

图13 小鼠肝脏（a）和肾脏（b）形态

血脂参数：模型组血清TC、TG、LDL-C、Apo-B水平显著升高，HDL-C、Apo-A水平显著降低；mGRE和SV组显著逆转上述变化，肝组织TC、TG水平变化与血清一致（图14）。

图14小鼠血清中 TC（a）、 TG（b）、HDL-C（c）、LDL-C（d）、Apo-A（e）、Apo - B（f）水平和小鼠肝脏 TC（g）和 TG（h）水平

肝功能指标：模型组血清ALT、AST水平显著高于对照组，GRE各剂量组和SV组均能不同程度降低ALT、AST水平，表明GRE对肝损伤有保护作用（图15）。

图15 小鼠血清中ALT（a）和AST（b）水平

肝组织病理：H&E染色显示，模型组肝细胞脂肪空泡大量堆积、排列紊乱，mGRE和hGRE组脂肪空泡显著减少；油红O染色结果一致，模型组脂质沉积明显，mGRE和hGRE组脂质滴显著减少（图16、17）。

图166 组肝脏组织H&E切片代表性图像

图17 6 组肝脏组织油红O切片代表性图像

Conclusion

本研究建立了一种稳定、低成本的阴离子交换树脂-超滤-pHPLC联用技术从炒萝卜籽中制备GRE。通过静态和动态实验优化，确定最佳树脂为D301-Cl⁻，最佳上样条件为：原溶液pH＝6、浓度0.10 g/mL、流速2 BV/h、上样体积7 BV、树脂直径与高度比1:8；最佳洗脱条件为：5 g/100 mL NaCl溶液、流速2 BV/h、洗脱体积4 BV。经超滤和pHPLC纯化后，GRE纯度达95.1%。

抗高脂血症实验表明，GRE对高脂血症小鼠具有明显的调脂作用，可降低体质量、改善血清和肝组织脂质水平、减轻肝脂质沉积并保护肝脏。本研究为GRE的制备提供了可靠方法，提高了萝卜籽利用率，同时证实了GRE的抗高脂血症活性，提示其有望开发为潜在的抗高脂血症药物或膳食补充剂，对高脂血症的日常预防具有重要意义。

Preparation of glucoraphenin by an integrated approach of anion exchange resin-ultrafiltration-pHPLC from stir-fried seeds of

Raphanus sativus

Zhuang Miaoa1, Shaohua Yua1, Yuanyuan Zhanga, Xinyue Yua, Huagang Shengab*, Honglei Zhouab*, Liqiao Zhuab*

a

College of Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China.

b

Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Classical Theory, Ministry of Education, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China

1

These authors contributed equally to this work.

*Corresponding authors.

Abstract

The objective of this study was to establish an efficient and low-cost method for preparing glucoraphenin (GRE) from stir-fried seeds of Raphanus sativus L., and then evaluate the anti-hyperlipidemia activity of GRE. The optimal resin was selected by comparing adsorption and desorption ability of six kinds of anion exchange resins for GRE. The loading and elution conditions of the optimal resin for GRE were then optimized by dynamic adsorption and desorption experiments. The results showed that D301-Cl⁻ resin was the optimal resin, and the optimal loading conditions were the original sample solution (pH = 6) with a concentration of 0.10 g/mL, the sample loading flow rate was 2 BV/h, and the sample volume was 7 BV. The optimum elution conditions were as follows: the elution solution was 5 g/100 mL NaCl, followed by subsequent elution with 4 BV at an elution flow rate of 2 BV/h. The collected eluent was further purified by ultrafiltration and preparative high-performance liquid chromatography (pHPLC) to obtain GRE, and the molecular weight and structure of GRE were determined by high performance liquid chromatography time-of-flight mass spectrometry and nuclear magnetic resonance, respectively. The purity of GRE was detected to be 95.1% by HPLC. Animal experiments showed that GRE had anti-hyperlipidemic effects by improving serum and liver lipid levels, alleviating liver lipid deposition, and protecting the liver. This study indicated that GRE may be a potential anti-hyperlipidemia drug candidate or dietary supplement.

Reference:

MIAO Z, YU S H, ZHANG Y Y , et al. Preparation of glucoraphenin by an integrated approach of anion exchange resin-ultrafiltration-pHPLC from stir-fried seeds of

Raphanus sativu

翻译：张庆芬（实习）

编辑：龚艺；责任编辑：梁安琪

封面图片来源：摄图网

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