北海道大学开发大型绿藻基因编辑敲入系统

受全球变化与人类活动双重影响，由石莼属（Ulva）绿藻引发的绿潮灾害对我国近海环境安全构成严重威胁。浒苔（Ulva prolifera）生长能力强，繁殖策略复杂，是造成中国沿海大规模绿潮的主要物种。浒苔具有多种用途，在日本是一种高价值的可食用藻类。此外，其多糖类组分也可用作医药工业等产品。目前，对浒苔的研究大多都还停留在生理层面，生长繁殖相关调控机制等尚不清楚，基础研究层面相对欠缺。

DNA双链断裂（DSB）被认为是一种DNA损伤类型。生物体修复DSB的主要途径有两种，即非同源末端连接（NHEJ）和同源重组（HDR）。NHEJ 修复途径是一个相对快速但容易出错的过程，而HR修复途径是一种相对缓慢但精准的修复途径。DSB修复是CRISPR基因编辑的基础之一。通过NHEJ可以实现基因敲除，而HDR可以实现基因的精准敲入。目前，大型藻类基因编辑技术的主要瓶颈之一是递送和基因敲入效率低，不能满足基础研究和生物育种的需求。因此，开发高效率的基因编辑递送和敲入系统迫在眉睫。

近日，北海道大学水产学院、育种生物学实验室Toshiki Uji团队在国际学术期刊BMC Plant Biology以Plant genome editing: advances and applications in plant biology专栏形式发表了题为Stable transgene expression and CRISPR-mediated knock-in system of a bacteria-derived antibiotic selection gene in the green alga Ulva prolifera的研究成果。该研究在大型绿藻浒苔中开发了一种新型外源抗生素筛选标记，并实现了基于HDR的外源基因片段精确敲入。获得了稳定敲入2272 bp外源标记的浒苔突变体。该研究报道的浒苔基因组精准敲入的策略，拓宽了大型海藻中大片段敲入的途径，为在大型海藻中对目的基因进行大片段的改造提供了工具。

石莼类生物对多种抗生素具有抗性，且有复杂的共生细菌相互作用，影响正常发育，限制了抗生素类标记的开发。本研究首先鉴定了浒苔内源强启动子（pUpRbcS），评估了不同转化体系的效率，建立了基于潮霉素B的筛选系统。获得了具有潮霉素B抗性的转化株，并实现了稳定遗传。

图1: 潮霉素B抗性质粒的构建和转化。a: 潮霉素B抗性质粒的构建和转化示意图；b：潮霉素B抗性株的筛选。c：潮霉素B抗性质粒的转化效率。

腺嘌呤磷酸核糖转移酶（APT）的敲除突变可阻止2-氟腺嘌呤（2-FA）转化为有毒的2-氟腺苷酸（2-FluoroAMP），已经开发为浒苔内源标记基因。作者克隆出潮霉素B抗性基因表达盒，靶向敲入到UpAPT中，获得了同时耐受2-氟腺嘌呤和潮霉素B筛选的突变体。测序证明潮霉素B抗性基因表达盒均已整合入基因组靶点位置，实现最大可达2272bp的片段敲入。

图2: 敲入突变体的构建和筛选a: UpAPT基因结构和敲入靶点示意图；b：敲入突变体的在潮霉素B和2-FA条件下的筛选。

综上，该研究在大型绿藻中开发了一种新型的抗生素筛选标记以及基于CRISPR的外源基因敲入系统。该方法的开发丰富了大型海藻的遗传操纵工具，为大型海藻基因功能等基础研究和精准育种提供了可行的技术支撑。同时敲入系统的开发标志着可以在基因组中插入具有不同功能的DNA片段。为开发大型海藻为生物制造的底盘提供了可能。

北海道大学水产学院、育种生物学实验室博士生秦政为该论文第一作者，Toshiki Uji副教授为通讯作者。

https://doi.org/10.1186/s12870-025-07411-y