金源康生物|告别反复失败——小鼠小胶质细胞培养避坑指南

在生命科学研究与生物制药的广阔领域中，细胞培养是探索未知的基石，而胎牛血清的品质，则是基石稳固的关键。内蒙古金源康生物工程股份有限公司，正是这一关键领域的硬实力担当。作为一家集研发、生产、销售于一体的国家级高新技术企业，金源康以“科技、创新、品质”为核心，构建了从优质血源到全自动生产的完整产业链，确保每一瓶血清都达到行业顶尖水平，为科研与产业的突破性发展提供源源不断的优质服务与保障。

小鼠神经胶质细胞分离自小脑组织，主要功能：

（1）神经胶质出现在大脑发育早期向成熟阶段转化的过程中。

（2）当程序性细胞死亡时，或在大脑发育的过程中，中枢神经系统受损或受到病理损坏时，神经胶质可作为大脑的巨噬细胞。

（3）胶质细胞能在II类组织相容性复合体表达CD-4阳性Ｔ细胞时表达抗原，能进行Fc 介导的巨噬作用，并且与造血细胞和巨噬细胞组织共享抗原。

一、细胞介绍

1.1.细胞参数

【细胞名称】小鼠神经小胶质细胞

【种属来源】小鼠

【组织来源】脑

【生长特性】贴壁生长

【形态特征】梭形、多角形

【培养条件】气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%；冻存条件：冻存液 40%FBS，DMSO 5%

【培养基】小鼠神经小胶质细胞专用培养基

【消化液】利多卡因（12mM）

【传代特性】属于终末分化细胞；属于不增殖细胞群

【生物安全等级】BSL-1

【保藏信息】ATCC

【培养基】DMEM+10%FBS+ 1% P/S

【冻存条件】液氮储存

【倍增时间】/小时

所用产品：

1.2.质控信息

【无菌检测】阴性

【支原体检测】阴性

【物种/STR鉴定】正确

二、培养操作

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2.1 复苏培养操作

（1）恒温水浴锅预热至37℃备用，或者细胞复苏仪开机预热准备；

（2）准备15ml离心管，并向其中加入8ml完全培养基（JYK-CN-0022M）待用；

（3）将细胞冻存管从-80℃冰箱或液氮中取出，放入PE手套中，迅速投入恒温水浴锅中或者直接置于细胞复苏仪中；

（4）在恒温水浴锅中，用力摇晃冻存管，使其在1分钟内融化；在细胞复苏仪中，按照程序操作即可；

（5）用纸巾或无尘布擦拭水渍，75%酒精消毒后转移至生物安全柜或者超净工作台。用移液枪吸取细胞悬液，缓慢滴加到步骤2中准备好的离心管；

（6）1000rpm离心5min；

（7）弃上清，用新鲜完全培养基（JYK-CN-0022M）重悬细胞，取样计数后，根据实验需要接种至新的无菌培养器皿中；

（8）镜检细胞状态，拍摄100x、200x照片各3张；

（9）置于37℃，5%CO2培养箱中进行培养，24h后镜检观察细胞复苏情况（贴壁情况或者激活情况）。

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2.2 传代培养操作

（1）取培养中的细胞，镜下观察细胞汇合和生长状态，若细胞汇合长至90%以上，即可传代，拍摄100x、200x照片各3张；

（2）去除培养上清，加入PBS（JYK-SH-001）清洗细胞（T25瓶，加入5ml；T75瓶，加入10ml）；

（3）加入0.25%胰酶（JYK-SX-002）（T25瓶，加入2ml；T75瓶，加入4ml），放入培养箱中或者室温下消化解离3min左右，可用显微镜观察状态，若观察到细胞离散成单个圆形、细胞间出现间隙、呈沙状移动，并悬浮在培养液中即可；

（4）加入完全培养基（JYK-CN-0022M）（T25瓶，加入5ml；T75瓶，加入10ml）终止消化，反复吹打瓶底和细胞，使其充分悬浮并吸取到离心管中，用PBS（JYK-SH-001）（T25瓶，加入5ml；T75瓶，加入10ml）再洗培养瓶一次，将两次液体集中到一支离心管中；

（5）1000rpm离心10min；

（6）将离心后的细胞液倒掉上清，轻轻敲击细胞沉淀，使其散开，加入1ml完全培养液（JYK-CN-0022M）稀释并充分混匀；

（7）计数，吸取细胞液20ul，加入20ul台盼蓝染液，混合均匀后吸取20ul混合液加入到细胞计数板计数，根据接种密度计算所需细胞液体积；

（8）根据实验需要，吸取一定量的细胞液加入到培养瓶，加入完全培养基（JYK-CN-0022M）（T25瓶，加入10ml；T75瓶，加入20ml），轻轻前后摇匀，在瓶身写好细胞名、培养代数、日期、姓名；

（9）镜下观察看是否已经摇匀，无误后放入培养箱37℃、5% CO2、90%湿度条件下培养。

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2.3 冻存操作

（1）取培养中的细胞，镜下观察细胞汇合和生长状态，若细胞汇合长至90%以上，即可传代，拍摄100x、200x照片各3张；

（2）去除培养上清，加入PBS（JYK-SH-001）清洗细胞（T25瓶，加入5ml；T75瓶，加入10ml）；

（3）加入0.25%胰酶（JYK-SX-002）（T25瓶，加入2ml；T75瓶，加入4ml），放入培养箱中或者室温下消化解离3min左右，可用显微镜观察状态，若观察到细胞离散成单个圆形、细胞间出现间隙、呈沙状移动，并悬浮在培养液中即可；

（4）加入完全培养液（JYK-CN-0022M）（T25瓶，加入5ml；T75瓶，加入10ml）终止消化，反复吹打瓶底和细胞，使其充分悬浮并吸取到离心管中，用PBS（T25瓶，加入5ml；T75瓶，加入10ml）再洗培养瓶一次，将两次液体集中到一支离心管中；

（5）1000rpm离心10min；

（6）将离心后的细胞液倒掉上清，轻轻敲击细胞沉淀，使其散开，先加1ml预冷冻存液（JYK-SD-003）混匀，再加入1ml预冷冻存液稀释并充分混匀；

（7）计数，吸取细胞液20ul，加入20ul台盼蓝染液，混合均匀后吸取20ul混合液加入到细胞计数板计数；

（8）根据计数结果，调节冻存液（JYK-SD-003）中的细胞最终密度为3×106/ml；

（9）将细胞分装入冻存管中，每管1ml；

（10）冻存管标记细胞名称，细胞代数信息、细胞密度、冻存时间，操作者。

（11）按照冻存程序进行细胞冻存。详细冻存程序见下表：

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三、注意事项

1. 部分细胞在传代后时，会有以下现象：细胞内会有黑色小点、细胞间隙有些颗粒物、培养基漂浮一些死细胞。以上都是细胞培养常见现象，不影响细胞增殖和实验。

2.细胞内的黑色颗粒是细胞外分泌泡、细胞器折光或者细胞膜表面物质，这个属于细胞自身特性，无法清除也无法改变，具体情况可以参考ATCC、DSMZ等大型细胞库细胞照片。细胞外的黑色颗粒大部分是细胞碎片，可以吸走培养基后用PBS润洗；润洗不能清除的可以消化细胞重新接种，消化完成后加完全培养基终止消化，混匀细胞，收集细胞悬液900-1000rpm(约150g)离心3min，弃上清。再加5ml PBS重悬细胞，再离心后，用完全培养基重悬接种到新的培养皿。第二次PBS重悬是为了去除碎片，如果平时碎片比较少，传代时可以省略PBS重悬的步骤；如果碎片很多，建议PBS多洗几次。

3.不同品牌消化液溶液成分不一样，消化活性差别比较大，更换消化液品牌时需重新摸索消化时间，以消化到细胞间隙变大但未漂浮为准，此时结束消化最佳，避免消化过度导致细胞死亡。细胞消化后比较脆弱，吹打力度不要过大，不要产生过多气泡，否则会严重影响细胞状态。

4.细胞生长偏慢时，可以提高5-10%血清浓度（血清总浓度不超过20%）培养一段时间，待细胞状态和生长速度恢复正常后换回正常血清浓度。

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