江南大学周志/天工所盛翔合作Nat. Commun.：融合代谢工程与遗传编码，创建人工新酶高效设计平台

酶催化因其温和的反应条件、高效的催化活性以及优异的手性控制能力而受到广泛关注。尽管通过天然酶的定向进化、结构修饰等方法可以拓展其催化性能，但与合成化学中策略多样的反应体系相比，能够适用于广泛转化的天然酶仍然有限。针对这一瓶颈，新酶创制被认为是推动绿色生物制造加速发展的关键路径之一。其中，人工酶借助遗传密码扩展技术将具备催化功能的非天然氨基酸引入蛋白质，从而在酶中构建新的催化中心，已成为新酶设计与构建的重要手段。然而，由于具备催化潜力的非天然氨基酸种类有限、成本高昂且获取难度较大，该领域的进一步发展依旧面临严峻挑战。在这一背景下，探索高效的非天然氨基酸获取策略，不仅有助于扩展酶催化的化学空间，也将为绿色合成化学和合成生物学的发展提供新的工具与方法学支撑。

江南大学周志教授课题组长期致力于新酶创制与催化研究，前期发展了基于非天然氨基酸与非天然辅因子引入的新型人工酶设计策略，开发了人工酶协同催化与酶级联催化体系（Nat. Catal. 2020, 3, 289; ACS Catalysis, 2021, 11, 9366; Angew. Chem. Int. Ed. 2023, 62, e202214191; Angew. Chem. Int. Ed.,2024, e202404312. ）。近日，江南大学周志教授联合中国科学院天津工业生物技术研究所盛翔研究员，在知名学术期刊Nature Communications上发表了新酶设计方向题为“Design and evolution of artificial enzyme with in-situ biosynthesized non-canonical amino acid”的研究论文。

本研究通过整合非天然氨基酸的生物合成与遗传编码体系，在细胞内原位合成并引入具有催化功能的巯基苯胺类非天然氨基酸，从而在蛋白质骨架中一锅法构建了一类新型人工傅-克烷基化酶（SFC）。在结合理性设计与定向进化的过程中，所得优势突变体在一例非天然不对称Friedel–Crafts烷基化反应中表现出卓越性能，产物对映选择性高达95% e.e.，产率最高可达98%。本研究建立了一种通用策略，能够利用细胞内生物合成获得的多样化非天然氨基酸高效引入外源性催化基团，实现人工酶的精准设计与构建。该方法不仅显著扩展了生物催化剂在非天然反应中的应用边界，也为人工酶学科的发展提供了新的工具与理论支撑。

研究内容

图1. 基于非天然氨基酸的人工酶设计策略

通过将非天然催化中心引入蛋白口袋是设计人工酶最直接的策略之一。遗传密码子扩展技术为蛋白质结构和功能的修饰提供了强大的技术支持，同样为创制具有非天然催化功能的人工酶提供了机会。目前，已有超过300种非天然氨基酸通过遗传密码子扩展技术被掺入蛋白中，但绝大多数需外源添加，而且通常价格高昂、合成难度大。相比于高效的化学催化剂，具有催化功能的非天然氨基酸种类有限，因此，将非天然氨基酸残基直接作为酶催化中心的人工酶设计策略仍然受到极大限制。开发能够整合进宿主细胞代谢的非天然氨基酸生物合成路径，并结合遗传密码子扩展技术，可显著拓展含非天然氨基酸人工酶用于生物催化的应用范围。这一策略对于人工设计酶的定向进化，以及将其整合至现有生物合成路径以构建混合代谢通路而言，更是一个极具吸引力的研究方向（图1）。

本研究通过整合S-芳香基半胱氨酸生物合成系统、兼容的正交翻译系统和目标蛋白质表达系统，创建了用于原位生物合成非天然氨基酸的人工酶。作者基于乳酸菌多药耐药调节（LmrR）蛋白二聚体构建人工酶，该蛋白因其特殊结构和可进化性已被研究证明是设计人工酶的多功能蛋白骨架。由于在苯胺对位引入硫原子能够改变半胱氨酸残基的电子云密度和链长，作者在蛋白骨架中引入S-(4-氨基苯基)-L-半胱氨酸（pAPhC）一种能够作为亲核催化剂活化醛基的ncAA，从而实现对非天然苯胺残基催化性能的精细调控，增强反应活性和选择性。通过将三个质粒（分别编码工程化CysM、OTS 和LmrR突变体整合到大肠杆菌中，构建了人工酶表达系统。作者只需在培养基中添加ncAA前体底物PhSNa，细胞工厂便可自动产生含有pAPhC残基的人工酶SFC_pAPhC。然而初步测试显示，SFC_V15pAPhC的表达水平较低，显著低于SFC_V15PhC和GFP_pAPhC。通过进一步优化细胞生长条件（如培养基、温度和前体浓度），SFC_V15pAPhC的表达水平提升至14 mg/L。为验证该系统的兼容性，作者成功构建了含非天然mAPhC、oAPhC和PyC的多种含硫醇类ncAA人工酶。这些结果表明，该体系提供了一种高效便捷的人工酶设计策略，并在建立多样化人工酶库方面展现出巨大潜力（图2）。

图2. 基于非天然氨基酸生物合成的人工酶设计

为了验证SFC_pAPhC的催化活性，作者选择通过亚胺催化机制研究吲哚与不饱和醛的不对称Friedel-Crafts烷基化反应。SFC_V15pAPhC催化1 mM 2-甲基吲哚和5 mM反式-2-戊烯醛，获得74%对映异构体过量值（e.e.）和39%产率，其构型为R型。值得注意的是，与先前报道的人工酶LmrR_pAF相比，本研究设计的SFC_V15pAPhC在催化同样的反应中表现出相反的对映选择性，这些结果表明硫原子的引入导致SFC_V15pAPhC与LmrR_V15pAF在反应活性和立体选择性方面产生显著差异（图3）。

图3. 人工酶SFC_pAPhC催化性能考察

基于SFC_V15pAPhC所展现出的良好对映选择性和活性，作者采用了迭代定点突变策略来优化人工酶。通过晶体结构指导(PDB: 8YRF)，首先采用丙氨酸扫描法系统评估了催化位点周边残基在Friedel-Crafts反应中的催化作用。经过三轮组合突变进化与反应参数优化，最终获得最优突变体SFC4.0（SFC_V15pAPhC_IRD），其对映选择性达95% e.e.，产率达98%。基于作者提出的催化机制，非天然pAPhC残基通过与2-戊烯醛形成亚胺离子中间体驱动Friedel-Crafts反应。作者通过高分辨率质谱成功捕获该关键中间体，直接证明了亚胺催化机制。动力学分析表明，进化后的SFC4.0突变体催化效率达0.64 ± 0.22 M⁻¹ s⁻¹，较SFC1.0（0.12 ± 0.04 M⁻¹ s⁻¹）提升5.5倍，证实定向进化策略显著增强了酶催化性能（图4）。

图4. 人工酶SFC_pAPhC的定向进化

随后，作者基于SFC1.0和SFC4.0，系统地考察了不对称Friedel-Crafts烷基化反应的底物适应性。烯醛底物（3a-3e）均能顺利转化，具有出色的对映选择性和产率。值得注意的是，针对肉桂醛底物，SFC1.0反而表现出比SFC4.0更优的选择性，表明不同突变体具有底物特异性。吲哚类底物中，无2-甲基取代的底物（3f-3i）虽对映选择性良好但反应活性较低；而2-甲基吲哚衍生物（3j-3m）均表现出优良选择性和产率。产物3f的绝对构型经文献比对确定为R型（72% e.e.），与LmrR_V15pAF相反。作者进一步构建了SFC4.0与天然转氨酶的级联催化体系，高效合成了手性色胺类化合物4，展现了人工酶在非天然产物合成中的应用潜力。动力学分析显示，SFC4.0 的表观催化效率（kcat/KM=0.64 M⁻¹s⁻¹）是原始酶 SFC1.0（0.12 M⁻¹s⁻¹）的5.5 倍，证明定向进化有效改善了酶与底物的结合能力及催化周转率（图5）。

图5. 人工酶活性考察与底物谱

与天工所盛翔研究员的合作计算研究揭示了导致SFC_V15pAF与LmrR_V15pAPhC立体选择性差异的关键因素。前者通过D100氢键和F93的π-π作用使甲基吲哚稳定结合Re面，生成S-构型产物；后者则通过N88氢键作用使底物优先结合Si面，产生R-构型产物。最优突变体SFC4.0中新引入的D92残基通过扩大Si面结合口袋进一步提升对映选择性。同时实验数据验证了88/92位点的重要性：N88突变导致活性降低，92位点不同突变体（L/S/H）的活性均低于A92D变体（图6）。

图6. 酶立体选择性的计算模拟研究

小结

本研究开发了一种基于非天然氨基酸原位生物合成的人工酶设计平台，通过整合代谢工程与遗传编码技术，实现了具有催化功能的非天然氨基酸在细胞内的高效合成与精准嵌入。由此构建的人工酶 SFC_pAPhC 在不对称傅克烷基化反应中展现出优异的催化性能，并在定向进化后进一步提升了其活性与对映选择性。该策略不仅为设计更多类型的人工酶提供了新的思路，也显示出在合成生物学与绿色生物制造中的潜在应用价值。更重要的是，该方法不仅适用于巯基苯胺类非天然氨基酸，还可拓展至含硼酸基团、金属结合位点等多样化催化残基的非天然氨基酸，从而为构建反应类型丰富、性能可优化的人工酶库提供了一条通用路径，并有望进一步推动生物催化在非天然产物合成中的广泛应用。

本论文共同第一作者分别为江南大学硕士研究生 黄薇 、天津工生所 王世平 博士，通讯作者为江南大学 周志 教授、天津工业生物技术研究所 盛翔 研究员。另外，特别感谢北京大学 刘涛 研究员对本课题中非天然氨基酸合成与引入体系构建的指导和支持。本研究得到国家重点研发计划（2021YFA0911500）、国家自然科学基金（22207043）、江苏省自然科学基金（BK20221092）等项目的支持。

作者简介

周志教授：江南大学教授、博导，主要从事新酶创制与催化研究。目前已在Nat. Chem., Nat. Catal., Nat. Commun., Angew. Chem., ACS Catal.等杂志发表一作/通讯论文多篇。欢迎有志于生物催化的同学报考课题组博士研究生，详见课题组主页：https://www.x-mol.com/groups/zhouzhi。

文献详情：

Design and evolution of artificial enzyme with in-situ biosynthesized non-canonical amino acid

Wei Huang, Shiping Wang, Ya Wei, Yuting Bai, Zhixi Zhu, Dejing Yin, Tao Liu, Xiang Sheng & Zhi Zhou

Nat. Commun.

https://doi.org/10.1038/s41467-025-63733-3

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