冷冻电镜Nature综述，前世今生，典型应用！

近日，欧美多国科学家于《Nature Reviews Drug Discovery》杂志发表重要综述，题为《Cryo-EM in drug discovery: achievements, limitations and prospects》（《冷冻电镜在药物发现中的应用：成就、局限与展望》）。该综述全面梳理了冷冻电镜（Cryo-EM）技术的发展历程，并深入探讨了其在药物筛选领域的应用前景【1】。

2017 年诺贝尔化学奖授予了 Jacques Dubochet、Joachim Frank 和 Richard Henderson 三位杰出的生物物理学家，以表彰他们在冷冻电镜（Cryo-EM）技术发展中所作出的推动性贡献。自他们取得突破后，众多生物学家得以更顺畅地开展研究，在发表科研成果方面也更为高效（相关评述指出，冷冻电镜技术获奖并不代表该技术已完全成熟）。

一直以来，结构生物学常遭人误解，甚至被不少“吃瓜群众”诟病。不少人认为结构生物学领域发表高水平文章很容易，不过是“灌水+搬砖”式的重复工作。然而，外行往往只看到结构的表象，对结构生物学在应用以及科学问题阐释方面的深度缺乏了解。正如颜宁老师所说：“拿到一个结构仅仅是起点，从结构中探寻大自然的奥秘才是结构生物学的核心价值所在！”

事实上，结构生物学的重要性不言而喻，从近几年（如 2003 年、2006 年、2009 年、2012 年）诺贝尔奖直接授予结构生物学家这一现象便可见一斑。这些获奖者并非始终专注于结构生物学研究，例如 2012 年诺贝尔化学奖得主 Brian K. Kobilka，他最初从事细胞生物学研究，后来转而投身结构生物学，致力于解析分子机制。他之所以做出这一转变，是因为深感只有结构生物学才能从原子层面解释 G 蛋白偶联受体（GPCR）的分子机理，解答他所关注的科学问题。此外，结构生物学在药物筛选领域也发挥着关键作用。

三足鼎立的时代

当前结构生物学领域主要有三大技术手段，即X-ray晶体衍射、核磁共振（NMR）和冷冻电镜（Cryo-EM）。在PDB数据库中，X-ray晶体衍射解析的结构占比高达约90%，NMR技术解析的结构占9%，而Cryo-EM解析的结构占比尚不足1%（如图1所示）。尽管占比有别，但这三种技术各有其独特优势和应用价值。

X-ray晶体衍射技术主要适用于分子量在10 - 150 kd范围内的蛋白质，超过150 kd的蛋白质晶体结构极为罕见，不过多数蛋白质的分子量处于这一区间。历经数十年的发展，该技术已成功解析超过12万个蛋白质结构，如今，要找到易于结晶的重要蛋白质已非易事。

NMR技术主要针对分子量小于50 kd的蛋白质，可直接对溶液中的蛋白质进行结构解析。然而，该技术对蛋白质的表达量和稳定性要求苛刻，因此其进一步深入发展的潜力相对有限。

Cryo-EM技术近年来异军突起，发展迅猛，大有取代X-ray晶体衍射之势【2 - 4】（例如已解析出分辨率达0.73Å的结构，揭示了淀粉样聚集蛋白功能性可逆的精密调控分子机制）。目前，Cryo-EM主要用于解析分子量大于150 kd的大蛋白质或复合物，且分辨率在3 Å以下的结构仍占少数，不过这一局面正在逐步改善。

图1. 结构生物学三种方法解析的结构比例

结构生物学在药物筛选中的应用

结构生物学一直在药物设计中扮演着重要的角色，它可以用于临床前药物设计的每一步，包括药物靶点的设计和鉴定，先导化合物优化等。由于能提供直接的证据，所以往往在筛药初期，可以对药物设计提供可靠的靶点，为小分子药物指明方向；在后期，直接提供结构生物学的证据，起到画龙点睛的作用。

结构生物学的三大方法对药物设计均有很大的帮助，但是也各自有各自的优缺点。X-ray晶体学是目前来说最高效、最强大，也是实际作用最大的方法，当靶点是可结晶的蛋白，一旦强大的结晶系建立，就可以快速和可重复地产生高分辨率结构，就可以源源不断的对蛋白进行位点突变或药物设计了；核磁共振（NMR）允许快速识别和分类，并提供有关系统动态的信息，但是该方法本身受到很多因素的限制，比如目标蛋白的覆盖范围不是特别广泛；Cryo-EM允许在溶液中确定大的和/或动态的大分子复合物的结构，而不需要获得晶体，甚至在它们的天然状态下即可实现，比如翻译后修饰的状态；此外，由于蛋白在接近天然状态下的溶液中是高度动态的，所以蛋白的不同构象状态可以在一个实验中解决。

Cryo-EM已经证明了其在靶标鉴定、验证等方面的实用性，通常涉及目标结构分析，以理解作用机制和评估可药用性。该分析需要参考天然的结构，理想情况下会结合其他方法的结果作为参考。自20世纪90年代以来，Cryo-EM已与X-ray晶体学结合使用了几十年，以解决不易结晶的大型复合物的结构。从EM密度图的轮廓获得的低分辨率分子包络（通过使用与对象的分子质量相关的阈值以去除与噪声对应的三位像素）可以给高分辨率晶体结构域、个别蛋白质或复合体提供近似轮廓，可与X-ray晶体学相辅相成。

结构生物学在药物开发中的应用，最好的例子当属GPCR了【1, 5, 6】。在2007年GPCR结构解析之前，药物筛选基本上就是处在盲筛和半盲筛的阶段。有了晶体结构之后，临床药物的开发迅速发展，上市药物也全面发展（图2）。

图2. a.近年来GPCR的临床阶段中的药剂数量；b. 每种受体配体类型在所有结晶GPCR中的比例 【6】

Cryo-EM技术的历史与现状

1931年，Max Knoll和Ernst Ruska发明了电子显微镜，并在1933年第一次打破了光镜的理论极限，使人类能够看到更加细小的颗粒。在发明之初，电镜并不被看好被用于对生物样品的观测。因为两个基本的问题摆在生物学家面前：一是电镜成像时，需要在真空中；二是成像时电子的辐射对生物样品的损伤很大。所以在之后的几十年里，科学家仅仅是用它做一些细胞形态学、病毒颗粒之类的负染，除此外，电镜在生物领域的贡献不太大。

但是技术瓶颈总是阻挡不住科学家求真的脚步！1981年，Jacques Dubochet和他的同事在电镜技术上取得了突破性进展——他们将快速冷冻的方法引入其中，即，将单个分子快速冷冻在单层的玻璃态的水（或者叫无定形的冰，vitrified water）中，即可解决上述两个基本问题。玻璃态化（Vitrification）的过程不仅可以使样品保持天然的状态，还可以保护样品在低温成像时免受脱水的危险，而冷冻本身也减少了由电子束引起的伤害。

尽管如此，在当时，要使电镜成像达到原子分辨率水平，还依然面临诸多挑战。比如说低信噪比、如何将2D成像转化为3D结构等问题。Joachim Frank和他的同事率先使用计算图像处理技术（computational image processing techniques），利用多个成像生物大分子拷贝的计算平均来改善信噪比的问题，得到不同角度的2D图像，再利用计算机软件进行3D重建，解析蛋白质的结构。近些年来众多的设备改善也极大促进了Cryo-EM技术的发展，比如高自动化程序的软件开发、高性能charge-coupled device（CCD）相机的应用等。正是由于这些技术的使用，Cryo-EM的应用才越来越广泛。

从电镜发明开始至今，解析的生物样品的结构大约有2200个（蛋白结构、病毒颗粒等）。1968年，第一个电镜结构被解析；1981年，有了冷冻样品的电镜技术；1999年，使用电镜技术解析的ribosome分辨率达到7.5 Å 【3】。大约2000年之后，电镜结构的数量开始逐年增长，但那时的分辨率一直不佳；而在2010年之后，用电镜技术解析的生物样品结构开始井喷式增长，2010年首次超过50个，分辨率也接近原子分辨率或近原子分辨率。目前总量已经接近2200个（图3） 。相信未来增长的势头会更加迅猛。

图3. Cryo-EM结构增长情况。数据来源于PDB数据库，截至2018年6月13日）

Cryo-EM技术在药物筛选中的应用前景

最近，单颗粒Cryo-EM为不适合结晶的蛋白提供了高分辨率结构，包括大型动态复合物和膜蛋白，技术进步使得Cryo-EM可用于研究更小的物体和分辨率更高的物体，包括与小分子的复合物。本节将通过几个例子重点介绍具有药物发现相关性的Cryo-EM结构。

5.1 膜蛋白

GPCRs。GPCRs是最丰富的细胞表面受体蛋白，并且被市场上约30％的药物所靶向 【5, 6】。尽管GPCR的X-ray晶体学研究取得了重大进展（这在历史上一直是非常具有挑战性的），但由于需要获得高质量晶体和纯化过程中相对较低的稳定性，X-ray对该家族的一些成员仍然难以应付。然而，cryo-EM可以确定GPCRs的不同构象以及与G蛋白复合物的结构，从而用于配体筛选或设计药物。以前，构象不稳定且不能结晶的大复合物无法成像，Cryo-EM则使其成为可能。2016年，单颗粒cryo-EM解析了第一个GPCR的cryo-EM结构（4.1Å），确定了激活状态下鲑降钙素、G蛋白和人降钙素受体（B类GPCR）的异源三聚体结构【7】。此后不久，结合兔胰高血糖素样肽（glucagon-like peptide 1, GLP1）、G蛋白和GLP1受体（B类GPCR）4.1 Å的cryo-EM结构被解析，解释了B类受体如何通过激素活化结合【8】。人类GLP1受体结合的激动剂和G蛋白异源三聚体的3.3 Å的Cryo-EM结构，给出了偏向激动作用（biased agonism）的见解【9】（图4）。分子量为150 kDa时，这种重要的药物靶点曾经被认为几乎不可能在近原子分辨率下使用cryo-EM成像，直到最近这些GLP1受体结构被解析出来。这些结构侧链清晰可辨，可帮助设计治疗II型糖尿病和肥胖症的新药，同时也为以后的更高分辨率GPCR蛋白复合物的解析提供了很好的样本范例。

图4. 偏向信号（Biased signalling）可以通过三种通用机制进行编码【5】

γ-分泌酶（γ-secretase）。γ-secretase是涉及淀粉样-β肽裂解的四组分170 kDa的膜内蛋白酶。γ-secretase的功能障碍是促进早发性阿尔茨海默病（AD）患者大脑中淀粉样斑块形成的原因，因此科学家有兴趣将其作为潜在的药物靶标。γ-secretase也作为Notch信号传导的关键介质参与癌症。在分辨率为3.4 Å的γ-secretase的cryo-EM结构中发现，四跨膜束内核（core of a four-transmembrane bundle）的两个热点突变，削弱了蛋白酶活性，从而引起早发性阿尔茨海默病。这个原子模型可以帮助设计更具选择性的化合物。值得注意的是，γ-secretase糖基化对Cryo-EM数据集的结构重建几乎没有影响，而它却可能妨碍X-ray的结晶【10】。

离子通道。各种离子通道结构已经在不同的分辨率下得到了解决，包括几种潜在的药物靶标。 这些包括：瞬时受体电位阳离子通道亚家族V成员1（TRPV1）【11-13】和TRPA1【14】通道，它们分别参与传感和传导温度和刺激物；电压门控钙通道Ca v1.1【15】和钠通道NavPaS【16】，它们分别涉及骨骼肌组织的收缩以及可兴奋细胞中动作电位的产生和传播。被解析的通道蛋白还有很多，特别要指出的是，冷冻电镜最近对TRP家族中的通道蛋白研究产生了巨大的影响，在过去的4年中，约解析出了50个冷冻电镜结构。历史上，获得良好衍射的TRP通道晶体非常困难，因为它们在细胞中的基因表达水平低，并且对化学和物理刺激非常敏感。结合激动剂的TRPV1（2.9 Å）【13】，TRPML3（2.9 Å）【17】和TRPM4（2.9 Å）【18】结构是目前为止由Cryo-EM解析的膜蛋白的最高分辨率结构。同样重要的是，Cryo-EM在研究极大离子通道复合物也具有无可估量的价值，如Ryanodine受体（RyRs）【19, 20】，它们是已知最大的离子通道之一，质量为2.2 MDa，介导细胞内Ca2+释放并且是心脏疾病的新兴治疗靶点。这些解析出来的离子通道蛋白结构，将成为药物设计的重要靶点，同时也再次证明了Cryo-EM技术的强大。

ATP结合蛋白（ABC）转运蛋白。Cryo-EM也揭示了X-ray衍射难以处理的其他膜蛋白复合物的结构。例如解析并阐明真核ABC转运蛋白多药耐药相关蛋白1（multidrug resistance-associated protein 1, MRP1）识别底物以及底物结合如何刺激ATP水解的机制【21】。ABC转运蛋白在多种药物的吸收，分布，代谢和消除中发挥关键作用，可导致药物相互作用，因此，有关其结构的信息可能对药物开发同样具有重要价值。

5.2 抗体和疫苗

要理解潜在生物治疗剂作用机制，必须通过表位作图分析阐明单克隆抗体（mAb）的活性。近年来，负染和cryo-EM已用于抗体的线性和构象表位作图。该方法仅需要微克量的抗体-抗原复合物，并且可以与其他表位定位技术结合使用，如氢-氘交换质谱（HDX-MS）或蛋白的快速光化学氧化（FPOP）技术。在最近的例子中，Long和他的同事使用cryo-EM阐明了病毒中和人mAb是如何结合病毒样颗粒，并阻断病毒和宿主膜融合的机制的【22】。Ciferri及其同事使用负染技术研究与HTRA1（一种与年龄相关的黄斑变性有关的丝氨酸蛋白酶）形成独特复合物并抑制其酶活性的抗体的结构【23】。该研究突出了IgG-HTRA1复合物的笼状结构，其较不紧凑的螺旋桨状排列，具有比Fab对应物更高的效力【23】。使用新的cryo-TEM技术可以进一步使表位作图更高效地辅助mAb设计。在抗体疫苗研究中使用cryo-EM的报道还有不少，该技术在研究动态目标中起着非常大的作用。

5.3 潜在的先导化合物优化

目前药物研发人员非常感兴趣的一个问题是，Cryo-EM是否可用于药物设计的命中导向和前导优化阶段，这往往依赖于基于结构的药物设计（structure-based drug design，SBDD）。为了使SBDD在这些阶段发挥作用，在短时间内（与候选药物开发时间相比）快速而夯实地产生多种结构的流程是先决条件；而当目标可以结晶时，高通量X-ray晶体学一直是黄金标准——用一系列化合物与蛋白共结晶或浸泡法来产生共晶体，再通过同步辐射光源进行衍射数据收集，以高通量自动化方式进行分子置换和配体模型构建，产生多重化合物-靶标复合物的结构。为了有效利用结构信息进行药物设计，分辨率理想情况下应该小于2.5 Å。

尽管最近在Cryo-EM方面解析的靶标复合物结构分辨率能够低于3 Å，但它还远没有X-ray高效。例如，一个限制是获得高分辨率Cryo-EM结构所需的时间框架仍然比X-ray晶体学慢几个数量级。尽管如此，一些例子说明了如果可以解决这些限制，Cryo-EM的潜力将是非常可喜的。Merk和他的同事确定了异柠檬酸脱氢酶（93 kDa）的3.8Å分辨率下的cryo-EM结构，并在结构上表征了小分子抑制剂结合引起的构象变化。Wong和他的同事确定了结合抗原生动物药物吐根碱【24】和甲氟喹【25】的恶性疟原虫80S核糖体的Cryo-EM结构，并且分辨率都达到了3.2 Å。

尽管在设计新的先导化合物中使用Cryo-EM的例子尚未见报道，但一些有希望的结果和正在进行的技术改进表明，Cryo-EM很快将被考虑作为SBDD的一个关键工具，特别是对难以结晶的目标，如膜蛋白。随着Cryo-EM产生的近原子分辨率结构的比例增加，相信制药行业的兴趣和期望也会越来越高。

5.4 其他蛋白

除了膜蛋白之外，Cryo-EM在获得对神经退行性疾病靶标蛋白的结构理解方面也取得很多进展。最近的成功例子是，从阿尔茨海默病患者的脑中分离出了第一个高分辨率结构（3.4-3.5Å）的tau蛋白细丝【26】，其特征是成对螺旋丝（PHF）和直丝（SF）组成的神经原纤维tau聚集体。PHF和SF的Cryo-EM结构揭示了tau聚集体分子构象异构之间的差异，发现了异构体如何被掺入到长丝中。这些细丝的高分辨率结构测定开启了基于结构的药物发现的新的可能性，例如设计特定的抑制剂。

药物筛选中X-ray晶体学与Cryo-EM的比较

在药物筛选领域，与 Cryo-EM 相比，X-ray 晶体学具有快速提供高分辨率结构数据的关键优势。一旦构建好合适的结晶系统，后续结构获取或化合物筛选效率极高：借助结晶自动工作站，1 小时内可设置约 2000 个结晶条件，2 - 3 小时就能通过图像识别软件评估出合适条件。在同步加速器上采集一套完整的晶体数据不到 2 分钟，后续的数据整合、结构解析以及蛋白质 - 配体复合物精修大多已实现自动化，通常 1 小时内即可完成。

然而，Cryo-EM 在筛选合适样品和冷冻条件时，效率远低于 X-ray 晶体学。一次分析仅能评估 12 个样品，充分表征这些样品又需 3 - 4 小时，通量比 X-ray 晶体学低了好几个数量级。

从通量角度看，X-ray 晶体学完全能满足药物配体筛选的需求。目前，利用不同化合物浸泡的约 500 个晶体数据，24 小时内即可收集完成（如英国 Diamond synchrotron 的 XChem 线站、上海 SSRF 的 BL17U 和 BL19U1 都有此能力），1 周内就能完成在线处理和精修（具体时间取决于结构解析人员的数量和熟练程度）。而 Cryo-EM 要达成相同目标，数据收集大约需要半年（假设每套数据收集 8 小时），计算和模型构建至少需要一年。即便按照这些乐观的时间估算，使用 Cryo-EM 进行配体筛选的速度，仍比 X-ray 晶体学慢 2 - 3 个数量级。

不过，Cryo-EM 也有自身独特优势。它能够轻松用于确定大分子在天然状态或动态状态（包括膜蛋白）下的结构，还能涵盖翻译后修饰的情况。而且，Cryo-EM 对蛋白质的需求量通常比 X-ray 晶体学少，这对于难以制备的蛋白质尤其有利。实际上，在药物研发中运用 X-ray 晶体学，获取合适晶体是一大难题，可能导致项目延误，特别是对于膜蛋白、重糖基化蛋白以及大型或柔性蛋白或蛋白复合物，能否持续获得稳定、可靠且高质量的晶体存在诸多不确定性。为应对这些挑战，人们开发了多种方法，例如将大型药物靶标缩减为单个结构域，以促进蛋白质生产、纯化和结晶。所以，在基于结构的药物发现项目启动时，通常需要投入大量时间和资源，以确保在筛选数百种化合物时具备足够的通量。

Cryo-EM 的另一大优势在于，相位信息在结构重建和实验过程中可直接获取，而 X-ray 晶体学中相位信息丢失，需通过实验进行相位重构，且这依赖于实验数据的准确采集。因此，对于 4 - 7.5 Å 范围内的分辨率水平，Cryo-EM 确定的结构通常能以 X-ray 晶体学无法达到的清晰度呈现单个结构域和二级结构单元。但当分辨率超过 3 Å 时，情况有所不同。目前，仅有小部分已发表的 Cryo-EM 结构分辨率超过 3 Å，并且许多情况下，Cryo-EM 获得的 3D 图谱在质量上难以与同分辨率下 X-ray 晶体学获得的图谱相抗衡。不过，需指出的是，X-ray 晶体学和 Cryo-EM 的分辨率确定方法差异很大，很多时候不能直接比较（详见下一部分）。

X-ray晶体学和Cryo-EM的分辨率比较

在 X-ray 晶体学里，分辨率是依据晶格的光子最大衍射、统计学，以及电子密度图谱与原子模型比较等标准来直接度量的【27】。而在 Cryo-EM 中，傅里叶壳层相关函数（FSC）是常用的分辨率确定工具，它通过衡量两个独立确定的三维图谱之间的一致性来发挥作用。具体而言，分辨率由相关性降至特定阈值（通常为 0.143）以下的空间频率来确定。FSC 本质上是对数据处理自我一致性的测量，正因如此，在 Cryo-EM 密度图中观察到的结构特征，有时会与该分辨率下应有的期望存在偏差。下图（图 5）展示了这一情况，图中呈现了一系列在不同模拟和实际计算分辨率下可视化的芳香族与非芳香族残基的 Cryo-EM 图。

图5. 芳香族和非芳香族残基的EM密度图

傅里叶壳相关系数（FSC）作为全局评估指标，仅能给出平均分辨率值。鉴于大分子结构具有柔性，且冷冻电镜（Cryo-EM）辐射图存在非各向同性分辨率分布，这一平均值具有误导性。在密度图定义最清晰的区域，分辨率可能被低估；实际上，所有 Cryo-EM 密度图的结构特征分辨率，都比 FSC 显示的要低。此外，FSC 也无法提供关于三维图谱计算质量的信息。

当前，不少提交至数据库的 Cryo-EM 结构报告显示分辨率约为 3.5 Å。与同分辨率的 X-ray 晶体结构相比，这些 Cryo-EM 结构在定义明确的区域结构特征更为清晰。一方面，如前文所述，FSC 的全局分辨率评估低估了明确特征区域的分辨率；另一方面，当分辨率高于 3.5 Å 时，X-ray 晶体学在结构解析上存在技术难题，这主要是因为其观测参数欠佳，导致从采集的振幅数据进行相位重构的效率低下，反映在数据质量较差上。不过，随着晶体学数据处理日益自动化且可靠，在更高分辨率下，这种情况会发生逆转。

与之形成对比的是，在 Cryo-EM 中，测定更高分辨率（<3 Å）的结构，比测定 3.5 - 4 Å 分辨率范围内的结构困难得多。Cryo-EM 结构测定中存在多个可能影响高分辨率测定的参数。例如，要区分可能属于同一大分子复合物不同构象的粒子图像极为困难，且样品中不同状态的数量越多，这一问题越突出。此外，光束损伤和电子光学像差等其他效应，也对高分辨率（<2.5 Å）结构测定形成限制。当试图确定<2 Å 分辨率下的可靠结构时，轴向彗形像差将成为 Cryo-EM 中主要的分辨率限制因素。

Cryo-EM技术的未来展望

8.1 目前Cryo-EM技术的瓶颈

Cryo-EM 传统上多用于分子量超 500 kDa 的生物大分子研究，但众多药物靶点为更小的蛋白或复合物。近年来技术进步使 Cryo-EM 理论上可处理小于 65 kDa 的样品，且已有显著突破，越来越多小于 200 kDa 的高分辨结构得以解析。

在样品制备方面，虽 Cryo-EM 对样品均一性要求不如 X-ray 严格，但均一性仍是保障样品完整度的关键。不均一样品会加大后期数据处理难度，降低数据分辨率与结构信息完整度。此外，优化 EM Grid 准备、数据采集等环节，也可提升 Cryo-EM 分辨率。随着科研人员持续探索，Cryo-EM 技术有望更强大、应用更广泛 。

8.2 Cryo-EM技术的未来

短短数年，Cryo-EM 技术进步显著，引领了一个新时代的到来。当下，结构生物学家正借助 Cryo-EM 研究大型蛋白质复合物、细胞机器及病毒的结构与功能。技术改进或使更多小膜蛋白结构得以解析，人们期待未来将步入“常规实现 2 Å 分辨率的黄金时代”，甚至有人认为 Cryo-EM 将凭借快速高效的优势，在诸多应用领域与晶体学竞争乃至取代它。

实际上，在制药行业部分应用中，Cryo-EM 已颇具吸引力。它无需始终达到 4 Å 以下的分辨率，低分辨率结构有助于理解目标蛋白、识别蛋白复合物结构域或结合伴侣间的结合口袋，药物设计时也未必需精准确定化合物结合模式。而且，尽管蛋白质动态变化引发的构象多样性限制了 Cryo-EM 结构分辨率，但重构各种中间状态有利于理解基于结构的药物设计（SBDD），能阐释复合体与底物结合的机制。

为抓住这些机遇，众多公司将目光投向 Cryo-EM，采用多种方式收集和处理 EM 数据，如与学术实验室合作（合作或付费服务）。尽管即将出现的类似同步加速器的设备有望满足 Cryo-EM 不断增长的需求，但仍存在诸多局限。晶体学在晶体数据收集、结构解析与优化方面速度极快，是多结构小分子项目的优质资源；而 Cryo-EM 每次数据采集需数小时甚至数天，通量远低于晶体学。不过，工业领域使用 Cryo-EM 的速度正迅速提升。要让 Cryo-EM 成为常规药物研发的首选方法，仍需开发相关工具，这需要大量资金投入与耐心。

最后，Cryo-EM 在药物研发中的应用，不仅取决于自身技术发展，还与晶体学的进步相关。如今，晶体结构筛选体系已十分完善、自动化、快速且易于量化，毕竟该领域已发展数十年。未来 Cryo-EM 的发展形式与速度难以预料，取代晶体学用于常规药物发现并非不可能。但更可能的情况是，尽管技术选择的界限正逐渐向 Cryo-EM 倾斜，但两种技术仍将在药物发现领域长期互补共进。

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