神经环路应用（10）：神经环路研究之顺行示踪技术

顺行示踪技术（Anterograde Tracing）是一种用于追踪神经元轴突投射方向和终点的神经科学研究方法。它从神经元的胞体（细胞体）出发，沿着轴突向前追踪信号传递路径，揭示“这个脑区向哪些下游区域发送信息”。

经典案例解析

Deconstructing the neural circuit underlying social hierarchy in mice

解析小鼠体内调控社交等级的神经回路机制

科学问题：

已知dmPFC是调控社交竞争的核心脑区，但此前其下游哪些脑区真正参与 “获胜” 或 “失败” 相关行为尚不明确。

顺行示踪主要用于绘制背内侧前额叶皮层（dmPFC）的全脑投射图谱，核心目的是从 “起点（dmPFC）到终点（下游靶区）” 可视化神经元的轴突投射路径及末梢分布，明确 dmPFC 的全脑下游投射范围，为后续筛选社交竞争相关通路提供基础。

技术原理：

首先，为明确 dmPFC 的下游投射范围，研究采用基于腺相关病毒（AAV）的示踪策略：通过病毒载体使 dmPFC 神经元表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP，标记神经元胞体），同时使轴突末梢表达突触素融合的 mRuby（一种红色荧光蛋白，标记突触末梢），以此完成 dmPFC 全脑投射的可视化 mapping并进一步证实 dmPFC 存在广泛的全脑投射。

1. 病毒选择与准备

选用 AAV2/8-hSyn-Synaptophysin-mRuby-T2A-H2B-EGFP 病毒，该病毒可在神经元内表达突触素融合的 mRuby（标记轴突末梢）和 H2B-EGFP（标记神经元胞核），实现对投射通路的可视化追踪。

2. 立体定位手术操作

实验小鼠（成年雄性 C57BL/6J 小鼠）经 1% 戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，固定于立体定位仪上，确保头部位置稳定。

病毒注射位点定位：以颅顶前囟（bregma）为基准，确定 dmPFC 注射坐标。

病毒注射操作：使用玻璃电极（尖端直径约 10-20 μm）连接压力微量注射器将病毒缓慢注入 dmPFC，注射体积为 0.2 μl / 位点，注射速度控制在 0.05 μl/min，以减少对脑组织的损伤。注射完成后，玻璃电极停留 10 min 再缓慢拔出，防止病毒回流。

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3. 病毒表达与动物恢复

手术后将小鼠单独饲养，置于标准环境（12 小时光/暗周期，食物和水自由获取）中恢复 4 周，确保病毒在 dmPFC 神经元内充分表达并通过轴突运输至下游投射靶区。

恢复监测：术后 1-3 天观察小鼠体重、活动状态及伤口愈合情况，确保无感染或手术并发症（如颅内出血、肢体瘫痪等），仅纳入状态良好的小鼠进行后续实验。

4. 组织处理与切片制备

灌注固定：4 周病毒表达后，小鼠经 1% 戊巴比妥钠（100 mg/kg 体重）深度麻醉，先通过心脏灌注 50 ml 0.1 M 磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗血液，再灌注 50 ml 4% 多聚甲醛（PFA）进行组织固定。

脑样本处理：取出完整脑组织，置于 4% PFA 中 4℃后固定过夜，随后转移至 30% 蔗糖溶液（溶于 0.1 M PBS）中 4℃梯度脱水（1-2 天），直至脑组织下沉，避免后续切片时产生冰晶损伤。使用冷冻切片机将脑组织切成 40 μm 厚的冠状切片，每套切片涵盖完整的 dmPFC 及全脑主要下游区域，便于后续染色和成像。

5. 荧光成像与数据分析：

切片染色与成像：

切片经 DAPI 或 Hoechst（细胞核染料）复染后，使用 Olympus VS120 虚拟显微镜切片扫描系统进行荧光成像，分别采集 mRuby（轴突末梢，红色荧光）和 EGFP（胞核，绿色荧光）的信号，确保清晰显示 dmPFC 下游靶区的轴突末梢分布。

Fig1 顺行示踪后全脑c-Fos映射实验

在此基础上，为筛选 dmPFC 下游真正参与社交竞争的脑区，研究通过钻管测试（tube test）构建实验模型：将经历社交竞争后确定的 “获胜小鼠”“失败小鼠”，与仅单独通过管子、无社交对抗的 “对照小鼠” 进行对比，检测三组小鼠全脑的 c-Fos 免疫反应模式（c-Fos 是神经元激活的标志物，其表达量可反映脑区激活程度）。对照组小鼠单独通过管子6次以排除行为本身的干扰，所有小鼠完成测试后在饲养笼中观察2小时再进行脑组织灌注固定与c-Fos染色，精准关联社交竞争结果与脑区激活；在c-Fos阳性细胞量化结果上，呈现dmPFC及10个主要下游靶区的激活差异。

实验共分析了 10 个脑区，包括 dmPFC 自身、腹内侧前额叶皮层（vmPFC）及 dmPFC 的 8 个主要皮层下下游靶区，最终在 5 个脑区中发现 c-Fos 表达的显著差异：获胜小鼠的 dmPFC 内 c-Fos 表达显著增加；其二，获胜小鼠的 dmPFC 下游三个皮层下脑区同样出现 c-Fos 表达增加，分别是背内侧丘脑（MDT、中缝背核（DRN）和导水管周围灰质（PAG）；其三，与获胜小鼠相反，失败小鼠仅在前基底外侧杏仁核（aBLA）这一个脑区出现 c-Fos 表达增加，且获胜小鼠该脑区无此变化。这些结果清晰划分出 dmPFC 下游与 “获胜”“失败” 行为相关的特异性脑区。

总结

通过清晰的实验设计、量化分析与可视化呈现，系统鉴定了dmPFC下游与社交竞争“获胜”或“失败”相关的关键脑区。证实 dmPFC 存在广泛的全脑投射，其中轴突末梢在多个皮层下脑区分布尤为密集，包括BLA、CPu、NAc及MDT，这些脑区成为后续社交竞争相关通路筛选的重点对象。

文献引用：

1. Xin Q, Zheng D, Zhou T, Xu J, Ni Z, Hu H. Deconstructing the neural circuit underlying social hierarchy in mice. Neuron. 2025 Feb 5;113(3):444-459.e7. doi: 10.1016/j.neuron.2024.11.007. Epub 2024 Dec 10. PMID: 39662472.

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