西湖大学开发相分离递送技术，重塑多种原代细胞CRISPR基因编辑治疗新格局

基因编辑技术CRISPR-Cas9被誉为“分子剪刀”，因其高效、精准和可编程的特性，迅速成为生物医学研究中的核心工具之一。这项革命性技术不仅极大地推动了基础生命科学的发展，也为遗传病、肿瘤等重大疾病的治疗提供了全新的策略。在众多应用方向中，各类功能细胞（尤其是免疫细胞和干细胞）的基因改造尤其受到关注。例如，原代 T 细胞作为适应性免疫系统的关键执行者，是开发 CAR-T、TCR-T 等前沿细胞疗法的重要载体；NK 细胞凭借其独特的靶向杀伤机制，成为 CAR-NK 等新型免疫治疗的热点对象；而干细胞的基因编辑更是在再生医学与多种难治性疾病的治疗中展现出广阔前景。对这类原代细胞进行精准高效的基因编辑，已成为生物医学研究及临床转化的重要前沿。

然而，尽管 CRISPR-Cas9 系统本身具备强大的编辑能力，其在原代免疫细胞和干细胞中的实际应用仍面临严峻挑战。这些细胞来源于人体外周血、组织或特定分化阶段，具有高度的生理敏感性和有限的体外扩增能力。它们对环境变化极为敏感，容易发生凋亡、分化或功能耗竭，且细胞膜结构往往致密，对外源大分子物质的摄入效率极低。这些共性生物学特性使得将 CRISPR 组件高效、安全地递送进细胞内部成为制约基因编辑成功的关键瓶颈。

目前常用的递送方法在各类原代细胞中各有局限。脂质体或阳离子聚合物等化学转染试剂在易转染细胞系中可能表现良好，但在原代 T 细胞、NK 细胞或干细胞中往往效率低下且细胞毒性显著；电穿孔技术虽能提高外源物质的导入率，但强烈的电流脉冲会对细胞膜和细胞稳态造成不可逆损伤，导致细胞存活率大幅下降、分化异常或功能丧失，严重影响后续研究与治疗应用；病毒载体虽然转导效率较高，却存在插入突变风险、免疫原性反应以及生产复杂、成本高等问题，在干细胞编辑中尤其需考虑其长期安全性，因此在临床前研究中仍限制较多。

因此，如何在不损害细胞活力的前提下，实现 CRISPR 基因编辑组件的高效递送，已成为提升基因编辑效率和临床应用可行性的核心难题。理想的递送系统应兼具高转染效率、低细胞毒性、良好的细胞功能维持以及临床转化潜力，才能满足从基础科研到治疗开发的多元需求。

一、CRISPR-Cas9工作机制：精准的基因“剪刀”

CRISPR-Cas9 系统的发现源于对细菌免疫机制的研究。自然界中，细菌和古菌为抵御噬菌体等外来遗传物质的入侵，演化出一套基于 CRISPR 序列的记忆性防御系统。经过科学改造，这一系统已被转化为一种强大而灵活的基因编辑工具，广泛应用于基因敲除、插入、调控等多种操作。

关键组分：

• Cas9 蛋白：一种核酸内切酶，负责切割 DNA 双链。

• sgRNA（单链向导RNA）：引导 Cas9 蛋白靶向特定基因序列。

编辑过程：

• 靶向定位：sgRNA 通过碱基互补配对，结合到目标 DNA 序列。

• DNA 切割：Cas9 在 sgRNA 引导下切割 DNA，形成双链断裂（DSB）。

• DNA 修复：细胞通过非同源末端连接（NHEJ）或同源定向修复（HDR）修复断裂，从而实现基因敲除或插入。

CRISPR-Cas9 系统的优势在于其高度的可编程性和靶向特异性，只需更换 sgRNA 序列即可靶向不同基因，极大提升了实验的灵活性与效率。然而，无论编辑设计多么精巧，若无法将其有效递送至目标细胞内部，尤其是像原代免疫细胞及干细胞这类“难转染”细胞，再先进的编辑策略也难以发挥其应有作用。

二、ProteanFect®递送Cas9基因编辑系统——原代免疫细胞、干细胞等基因编辑新策略

为突破原代免疫细胞、干细胞等难转染细胞的基因编辑中的递送瓶颈，西湖凝聚体与西湖大学联合开发了 ProteanFect®CRISPRMax Ultra 转染试剂盒。该系统基于创新的生物分子凝聚体技术，专为高效递送 RNP 复合物/Cas9 mRNA-sgRNA 复合物至难转染的原代细胞（原代 T 细胞、B 细胞、NK 细胞、干细胞等）而设计，展现出卓越的转染效率与细胞兼容性，为免疫学与细胞治疗研究提供了强有力的技术支持。

与传统递送方式不同，ProteanFect®不依赖脂质包裹或电穿孔等物理化学手段，而是模拟细胞内天然的相分离现象，利用功能性内源蛋白与 CRISPR-Cas9 基因编辑系统自发组装形成动态的生物分子凝聚体。这种凝聚体结构能够温和地携带 RNP 复合物/Cas9 mRNA-sgRNA 复合物，通过细胞的内吞途径进入胞内，避免了剧烈处理对细胞造成的应激损伤。

ProteanFect®递送系统实现基因编辑的分子机制如下（图1）：

• 凝聚体组装：RNP/Cas9 mRNA-sgRNA 与 ProteanFect®内源蛋白一起组装成为凝聚体复合物；

• 细胞摄取：凝聚体通过胞吞吸收，递送进入细胞内；

• 胞内释放与转运：复合物释放并进入细胞核与靶 DNA 结合；

• 靶向编辑：精准切割靶基因，实现高效基因编辑。

图1. ProteanFect®RNP-based CRISPR及mRNA-based CRISPR递送原理

这一递送策略有效规避了电穿孔带来的高细胞死亡率和病毒载体潜在的安全风险，同时在编辑效率上优于传统化学试剂的转染方法。更重要的是，使用 ProteanFect®处理后的原代细胞通常保持较高的存活率和功能完整性，有利于后续的功能验证、扩增或回输实验。该系统的操作极为简便，无需复杂的设备或繁琐的预处理步骤。

ProteanFect®CRISPRMax Ultra的出现，标志着原代免疫细胞基因编辑正从“高难度操作”向“标准化流程”转变。它不仅提升了实验的可重复性与成功率，也为大规模筛选、多基因编辑以及临床前研究提供了可靠的技术平台。

三、ProteanFect®CRISPRMax Ultra高效基因编辑各种原代细胞成功案例

1. 小鼠原代 T 细胞

利用ProteanFect®CRISPRMax Ultra 小鼠免疫细胞转染试剂盒（货号：PT09）对小鼠原代 T 细胞进行基因编辑：采用 Trac sgRNA/Cas9 蛋白（RNP）转染的方案，结果如下图 2 所示。基因组水平检测（图2左）显示小鼠T细胞整体 DNA 突变率达 84.3%，蛋白水平检测（图2右）显示蛋白敲低效率达 86.3%。

图2. 使用ProteanFect®CRISPRMax Ultra小鼠免疫细胞转染试剂盒对小鼠原代T细胞进行基因编辑

2. 人原代 T 细胞

利用ProteanFect®CRISPRMax Ultra 转染试剂盒（货号：PT08）对人原代 T 细胞进行基因编辑：采用 TRAC sgRNA/Cas9 蛋白（RNP）转染的方案，结果如下图 3 所示。基因组水平检测（图2左）显示人 T 细胞整体 TRAC 突变率达 80.1%，蛋白水平检测（图2右）显示蛋白敲低效率达 85%。

图3. 使用ProteanFect®CRISPRMax Ultra转染试剂盒对人原代T细胞进行基因编辑

3.iPSC 诱导多能干细胞

来自斯坦福大学的研究团队利用 ProteanFect®成功递送 PE7 基因编辑系统至 PBMC 来源的 iPSC，并实现精准点突变（c.757G>T），碱基替换效率达 55%，进一步验证了该试剂在难转染干细胞中的高效基因编辑能力（图4）。

图4. 使用ProteanFect®递送PE7系统进入iPSC进行基因编辑

四、迈向高效与温和的基因编辑新时代

随着精准医学和细胞治疗的快速发展，对多种功能细胞进行高效基因编辑的需求正持续增长。无论是免疫细胞（例如 T 细胞、NK 细胞、巨噬细胞）还是多能干细胞或造血干细胞，其在疾病建模、再生医学和新型细胞疗法开发中都占据核心地位。而像 ProteanFect®这样的创新递送技术，正在为这一广阔领域注入新的活力。它不仅是一项技术进步，更代表了一种研究范式的转变——使我们能够以更温和、更高效的方式与细胞“对话”，在最大程度保持细胞功能与状态的前提下，实现对基因组的精准调控。

未来已来，基因编辑的大门正因这些关键而细腻的技术突破越开越大。对于每一位致力于免疫治疗、基因工程与再生医学的研究者而言，掌握一类高效、安全且适用于多种难编辑细胞类型的递送工具，或许正是迈向下一代生物医学发现与临床转化的第一步。

关于西湖凝聚体

西湖凝聚体生物是专注于核酸递送领域的国家级高新技术企业，已服务国内外大量顶尖高校及科研机构。我们成功研发了全球首个基于哺乳动物内源蛋白的凝聚体核酸递送平台，为高效基因递送提供了创新解决方案。

我们的首个产品 ProteanFect®转染试剂系列，显著提升了原代细胞和难转染细胞系的基因递送效率，助力全球科研工作者更高效便捷地开展基因研究。同时，我们正与全球药企和生物技术公司紧密合作，开发一系列前沿基因治疗临床产品。欢迎全球研究者和合作伙伴与我们携手，共同推进更创新、更高性能的基因递送系统和产品的开发。

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