如何做好原位杂交实验？

原位杂交（In Situ Hybridization，ISH）是一种在细胞或组织原位检测特定核酸序列的常用分子生物学技术，其核心是利用核酸分子的碱基互补配对原则，通过带有标记的探针与靶核酸结合，从而定位靶核酸的存在位置和分布情况。该技术因能保留样本的空间结构信息，在医学诊断、生物学研究等领域具有不可替代的作用。但想要做好原位杂交实验，并没有那么容易，本文将从原位杂交原理、探针类型和实验要点来阐述说明，帮助大家更快了解该实验技术，新手也可放心食用哦！

一、原位杂交基本原理

原位杂交的核心原理是碱基互补配对：

带有标记物的核酸探针（与靶核酸序列互补）与细胞或组织中的靶核酸（DNA或RNA）在适宜条件下发生变性（双链解旋为单链）和复性（单链探针与单链靶核酸结合形成双链杂交体）。

通过检测探针上的标记物（如放射性同位素、地高辛、生物素等），即可确定靶核酸在细胞内或组织中的具体位置和表达/分布模式。

二、原位杂交探针类型

根据原位杂交探针的标记物是否具有放射性，可分为同位素标记探针和非同位素标记探针两类。

l同位素标记探针法是用放射性同位素标记探针与靶核酸进行杂交，杂交后可用敏感性高的放射自显影技术检测。常用的放射性同位素如3H、32P、35S、125I等。

l非同位素标记探针法一般用半抗原标记探针，如生物素（Biotin）、地高辛素（DIG）等，最后通过免疫组织化学法对半抗原定位，间接地显示探针与靶核酸形成的杂交体。

原位杂交最初是以同位素标记探针进行的，这种方法敏感性高，但核素具有半衰期限制、放射性污染且该方法成本高、耗时长，对实验人员具有辐射危害。而非同位素标记探针虽然在敏感性方面不如同位素标记探针，但其稳定性和分辨力高，检测时间短，一般在24h即可得到结果，同时操作简便，没有放射性污染的安全问题。因此，非同位素标记探针(尤其是生物素标记探针和地高辛标记探针)迅速发展，逐渐成为原位杂交技术的主流方法。

三、原位杂交实验要点

1、探针合成

合成探针是进行原位杂交实验的第一步，对杂交检测结果的精确性也起着重要作用。通常，探针合成试剂盒能够使得标记核苷酸掺入的比例越高，探针活性就越高，其检测灵敏度也就越高。虽然说市面上不乏可以选择的探针合成试剂盒，但研究者还是应该比较各家试剂盒的质量与性能。建议选择研发经验丰富、已获市场长期验证过的试剂品牌，比如罗氏Roche，其相关探针合成试剂盒一直在市场上享有盛誉，就是纯进口试剂的价格比较高，货期较久；也可以选择国内BIOG的，产品种类多，能够满足客户多样化的探针合成需求，像地高辛标记探针（PCR法）、生物素标记DNA探针（PCR法）、生物素标记RNA探针（体外转录法）等等，这些探针合成试剂盒的反应体系经过反复优化，能够将标记核苷酸最大化比例掺入到探针中，使之获得极高的检测灵敏度。

下面是我们实验室曾经做过的斑点杂交实验检测结果，使用BIOG试剂盒合成的Biotin-GAPDH RNA探针，可检测低至0.16ng的目标产物。

2、通透

通透步骤是连接样本固定与杂交的桥梁，是确保原位杂交实验成功的关键环节之一。我们都知道，细胞和细胞核都由脂质双分子层膜结构包裹（细胞膜和核膜），这些膜正常情况下是选择性通透的，会阻挡像探针这样的大分子进入，而通透液可有效溶解细胞膜和核膜上的脂质，在膜上形成暂时的、微小的孔洞，这些孔洞使得探针分子能够穿过膜屏障，进入胞浆和细胞核。简单来说，就是为探针打开“通道”，使其能够进入细胞或组织内部，与靶DNA或RNA结合。

研究者在进行该步骤时需重点关注通透浓度与处理时间，如通透不足，则探针无法有效进入，会导致信号微弱甚至无信号；如通透过度，会严重破坏细胞的组织结构和形态，导致细胞核碎裂、细胞轮廓消失，即使有信号也无法进行准确的定位分析。因此，作为实验新手，可先参考Roche、BIOG这些成熟品牌试剂盒的说明书来操作，往往这些品牌研发人员都具备丰富的实验经验，可帮助实验者更快掌握样本通透的最佳条件。另外，国内百代生物的通透液中具有独特的通透因子，不仅能帮助在细胞膜上进行高效打孔，使探针更容易进入，而且还可有效避免对胞浆胞核造成损坏，大大提高了原位杂交实验的成功率。

3、杂交

杂交是整个原位杂交实验中的核心步骤，能决定杂交结果好坏的最关键成分便是杂交液。其作用是创造一个最优化的化学环境，确保探针能够高效、特异性地与它的靶核酸（DNA或RNA）结合，同时最大限度地减少非特异性结合。但杂交液的成分与配方往往较为复杂，市面上的杂交液性能也都参差不齐。据悉，BIOG的亲和杂交液经过反复优化，不仅能促进特异性杂交，充分封闭组织细胞中探针的非特异结合位点（阻断非特异性结合），还特别添加了稳定剂成分，能将探针分子“困”在局部区域，有效增加探针的相对浓度，从而大大加速杂交反应速率，更能使杂交体保持稳定。研究者可优先选择这类性能的杂交液，来提高原位杂交实验的成功几率。