基于细胞基质的流感疫苗：日本研发进展与挑战

摘要：季节性流感每年导致全球数十亿人感染，接种疫苗是最有效的预防手段。长期以来，流感疫苗主要依赖鸡蛋培养技术，但这种方法存在鸡蛋适应性突变等局限，可能降低疫苗效果。为突破这一困境，日本近十年全力推进哺乳动物细胞培养疫苗技术，建立了专用细胞系、优化了病毒分离与生产流程，并在安全性和有效性评估上取得重要进展。本文系统梳理了日本在细胞培养流感疫苗研发中的关键突破，包括 NIID-MDCK 细胞系的建立、病毒分离效率的提升、抗原稳定性的验证等，同时剖析了当前面临的技术瓶颈与未来发展方向，为理解流感疫苗技术革新提供全面视角。

一、流感威胁与疫苗技术的 “鸡蛋困境”

流感作为一种急性呼吸道传染病，每年在全球范围内引发约 10 亿感染病例，其中 300 万 - 500 万为重症，29 万 - 65 万例死于呼吸道并发症（WHO 数据）。接种季节性流感疫苗是公认的最有效预防手段，在病毒株匹配良好的年份，能将感染风险降低 40%-60%。

但长期以来，包括日本在内的多数国家，流感疫苗生产依赖鸡胚培养技术—— 即把病毒接种到受精鸡蛋中繁殖，再提取病毒抗原制成疫苗。这种方法看似成熟，却暗藏 “先天缺陷”：病毒在鸡蛋中繁殖时，表面的血凝素（HA）抗原（疫苗诱导免疫的关键靶点）可能发生鸡蛋适应性突变。简单说，就是病毒为了在鸡蛋里“存活”，会悄悄改变自己的“外貌”，导致疫苗里的病毒株与实际流行的病毒株 “长得不一样”（抗原 mismatch），直接削弱疫苗保护力。

此外，鸡蛋培养还存在其他局限：比如需要大量受精鸡蛋，供应易受禽流感等因素影响；生产周期长（约 6-8 周），难以应对突发疫情；部分人对鸡蛋蛋白过敏，无法接种等。这些问题让科学家们意识到，必须找到更可靠的替代技术 ——细胞培养疫苗由此成为研发热点。

二、细胞培养疫苗：超越鸡蛋的技术优势

细胞培养疫苗，简单说就是用哺乳动物细胞（而非鸡蛋）作为 “培养皿” 繁殖病毒。自 2010 年起，日本开始系统研发这一技术，其核心优势被逐步验证：

避免抗原突变：细胞培养环境更接近人体生理条件，病毒繁殖时不易发生抗原突变，能保证疫苗株与流行株 “外貌一致”，提升保护效果。

生产更灵活：细胞可在生物反应器中大规模培养，不受鸡蛋供应限制，疫情暴发时能快速扩产。

安全性更高：无需鸡蛋成分，可避免鸡蛋过敏风险；生产过程中微生物污染概率更低。

免疫原性更强：研究显示，细胞培养疫苗诱导的抗体反应往往比鸡蛋疫苗更持久。

目前，全球已有两种细胞培养疫苗获批：澳大利亚 CSL Seqirus 公司的 Flucelvax Quadrivalent（四价疫苗）和韩国 SK Bioscience 公司的 SKYCellflu（三价/四价）。其中，Flucelvax Quadrivalent 使用MDCK 细胞（犬肾细胞）培养，自 2019/2020 流感季起，其包含的 4 种病毒株（H1N1pdm09、H3N2、B/Yamagata、B/Victoria）均通过 MDCK 33016-PF 细胞系繁殖，已在欧美获批用于成人和儿童。SKYCellflu 则使用 MDCK-Sky3851 细胞，2019 年获 WHO 预认证，目前已在 11 个国家上市。

三、日本的攻坚：从细胞系建立到疫苗生产体系

为实现细胞培养疫苗的国产化，日本国立传染病研究所（NIID）牵头开展了一系列关键研究，核心是解决 “用什么细胞培养”“如何高效分离病毒”“怎样保证疫苗质量” 三大问题。

（一）NIID-MDCK 细胞系：专属 “病毒培养皿” 的诞生

MDCK 细胞是目前最常用的流感病毒培养细胞，但传统 MDCK 细胞对部分病毒株 “不友好”—— 有些病毒在里面长得慢、产量低。为此，NIID 从原始 MDCK 细胞（ATCC CCL-43）中筛选并改良，建立了NIID-MDCK 细胞系。

这种新细胞系有两个关键特点：

可在无血清/无蛋白培养基中生长，避免血清带来的污染风险；

加入胰蛋白酶后，病毒繁殖效率显著提升，能从临床样本中直接分离出病毒。

为确保安全性，NIID 还联合英国 BioReliance 公司对该细胞系进行全面检测，确认其无外源污染物，符合疫苗生产的细胞 substrate 标准。这一细胞系后来被列入 WHO 推荐清单，成为全球首个被国际认可的日本原创疫苗用细胞系。

（二）病毒分离效率：NIID-MDCK 细胞的 “实战表现”

疫苗生产的第一步是从患者样本中分离出病毒（即 “种子病毒”）。NIID 团队测试了 NIID-MDCK 细胞对不同流感病毒株的分离能力，结果显示：

对于A(H3N2)和B 型流感病毒（包括 Yamagata 和 Victoria 系），NIID-MDCK 细胞与传统 MDCK 细胞表现相当，经过几次传代后，血凝素（HA）滴度（反映病毒产量的指标）能达到较高水平（表 1）。

对于A(H1N1)pdm09（2009 年大流行株），NIID-MDCK 细胞的初始分离效率略低于传统 MDCK 细胞，但如果选择病毒含量高的临床样本（Ct 值≤24，Ct 值越低表示病毒越多），仍能高效分离（表 2）。

这意味着，NIID-MDCK 细胞可作为通用 “捕手”，从临床样本中捕获绝大多数流行病毒株，为疫苗生产提供合格的 “种子”。

表 1. NIID-MDCK 细胞与传统 MDCK 细胞的病毒分离效率及 HA 滴度对比

表 2. NIID-MDCK 细胞对 A (H1N1) pdm09 病毒的分离效率（按 Ct 值分类）

（三）抗原稳定性：疫苗 “有效” 的核心保障

疫苗是否有效，关键看其包含的病毒抗原与流行株是否 “一致”。研究团队通过血凝抑制试验（HI 试验）验证了 NIID-MDCK 细胞培养的病毒抗原稳定性：将临床样本在 NIID-MDCK 细胞中传代后，分析其 HA 和 NA 基因序列，并与 WHO 推荐的 “标准株” 对比。

结果显示，尽管部分病毒在传代中会出现少量基因变异（氨基酸替换），但绝大多数病毒株的抗原性与标准株 “等效”（HI 滴度差异在 2 倍以内），符合疫苗生产要求（表 3）。这意味着，用 NIID-MDCK 细胞培养的病毒株，能保持 “原汁原味” 的抗原特征，为疫苗有效性奠定基础。

表 3. NIID-MDCK 细胞分离病毒的抗原性分析（HI 试验结果）

（四）安全性把关：多重 PCR 揪出 “不速之客”

疫苗生产中，最担心的是外源病毒污染（比如临床样本中可能混有的其他呼吸道病毒）。为此，NIID 团队开发了多重实时 PCR 检测系统，能同时检测 42 种常见病毒。

测试显示，该系统灵敏度极高：在 34 份 NIID-MDCK 细胞培养的病毒样本中，仅 2 份检测到微量人肠道病毒 D68（HEV-D68），且这些病毒无法在 NIID-MDCK 细胞中繁殖，传代后便消失（表 4）。更重要的是，对 8 种常见呼吸道病毒（如腺病毒、冠状病毒 OC43、SARS-CoV-2 等）的测试发现，它们在 NIID-MDCK 细胞中传代后，病毒载量会快速下降，甚至低于检测极限。这说明，NIID-MDCK 细胞 “免疫力强”，不易被其他病毒污染，进一步保障了疫苗安全性。

表 4. 常见呼吸道病毒在 NIID-MDCK 细胞中的传代清除情况（病毒基因组拷贝数/毫升）

（五）产量升级：让病毒 “疯长” 的改良细胞系

尽管 NIID-MDCK 细胞表现优秀，但部分病毒株（如 H1N1pdm09）的产量仍有提升空间。研究发现，细胞中的干扰素调节因子 7（IRF7）会抑制流感病毒繁殖 ——IRF7 是细胞的 “抗病毒卫士”，激活后会启动免疫反应清除病毒。

于是，团队通过基因编辑技术（如 RNA 干扰、CRISPR/Cas9）敲低 NIID-MDCK 细胞中的 IRF7 基因，得到 “改良版” 细胞系（NIID-MDCK-shIRF7）。测试显示，这种细胞能让流感 A 和 B 型病毒的 HA 滴度提升 2-8 倍（表 5），大大提高了疫苗生产效率。

表 5. 改良型 NIID-MDCK 细胞（shRNA-IRF7）的病毒产量提升效果（HA 滴度）

（六）质量控制：给细胞疫苗 “打分” 的新标准

疫苗 potency（即有效成分含量）是核心质量指标，传统鸡蛋疫苗用单径向免疫扩散法（SRD）检测，但细胞疫苗缺乏对应的标准试剂。NIID 团队从细胞培养的病毒中提取血凝素（HA），制备了纯化初级液体标准品（PLS）和参考血清，成功将 SRD 法应用于细胞疫苗检测。

结果显示，用这套系统检测的四价细胞疫苗，HA 含量均稳定在 15μg/0.5mL 左右，与设计标准一致。这意味着，细胞疫苗有了专属 “质量标尺”，为规模化生产提供了关键保障。

四、前路仍有挑战：从实验室到普及的 “最后一公里”

尽管日本在细胞培养疫苗技术上取得突破，但要实现大规模应用，仍需跨越多重障碍：

病毒分离的“漏网之鱼”：部分流感株（如近年来的 H3N2）在 MDCK 细胞中繁殖能力弱，还可能发生细胞适应性突变（类似鸡蛋突变的问题），导致抗原改变。这需要开发更 “包容” 的细胞系，或结合基因编辑技术优化病毒适应性。

成本与产能的博弈：细胞培养疫苗的生产成本目前高于鸡蛋疫苗，主要源于细胞系维护、生物反应器设备等投入。如何通过技术优化降低成本，是商业化的关键。

资源与协作的短板：日本疫苗研发依赖少数机构，产学研协作不足，且研发资金有限。相比之下，欧美企业更积极布局，日本需加强跨部门合作，吸引企业参与。

证据与认知的差距：虽然已有研究显示细胞疫苗更有效，但长期临床数据仍不足，公众和医疗机构对新技术的接受度有待提升。

五、未来展望：细胞疫苗的 “黄金时代”？

尽管挑战重重，细胞培养疫苗的潜力已被广泛认可。日本作为首个将细胞疫苗研发纳入国家项目的国家，其经验为全球提供了重要参考：NIID-MDCK 细胞系被 WHO 推荐，意味着未来全球可共享这一资源，加速细胞疫苗普及。

更重要的是，多项临床研究证实，细胞培养疫苗的相对保护力高于鸡蛋疫苗 —— 比如 2019/2020 流感季，美国数据显示细胞四价疫苗预防成人流感的效果比鸡蛋疫苗高 16%。随着技术成熟，未来细胞疫苗可能成为主流，尤其在应对流感大流行时，其快速扩产能力将发挥关键作用。

总之，从鸡蛋到细胞，流感疫苗技术的革新不仅是科学突破，更是应对全球健康威胁的 “安全网升级”。日本的探索告诉我们，这条路虽难，但值得坚持。

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