科学家研发空间转录组技术，用立体DNA显微镜重构3D基因表达图谱

近日，日本京都大学博士毕业生、目前在美国芝加哥大学从事博士后研究的钱年超和合作者开发出一种全新的空间转录组技术——立体 DNA 显微镜。

研究中，他们成功重构了 24hpf 斑马鱼胚胎的三维形态，并以三维方式重现了 Stereo-seq 捕获的空间基因表达模式，证明该技术在构建组织样品三维空间转录组上的可行性。

另外，他们还开发了一种名为测地谱嵌入（GSE，Geodesic Spectral Embeddings）的数据降维方法，其能处理测序数据以及重构斑马鱼胚胎的图像，为非线性大数据的降维提供了一种新工具。

之所以能够实现以上成果，是因为他们在无需依赖微流控系统、光学显微镜等特殊设备和先验知识的前提下，使用滚环扩增这一等温扩增方法产生的 DNA 纳米球可以将 RNA 的遗传信息进行空间编码，进而能够使用 DNA 分子标记 DNA 纳米球的邻近关系，而后可以针对 DNA 进行测序和数据分析。

论文发表之后，钱年超等人受到Nature Biotechnology期刊编辑邀请发表了一份研究简报，该简报由钱年超等论文作者、期刊编辑和行业专家共同完成的，是对本次成果的概括和评价。在简报中，专注于单细胞空间蛋白质组学的生物技术公司的瑞典公司 Pixelgen Technologies 的 CEO 西蒙・弗雷德里克松（Simon Fredriksson）教授评价称：“这项工作为三维、无偏见地分析生物学提供了一条途径，这将是一项伟大的成就。在没有光和荧光团的情况下定位生物分子具有远远超出传统显微镜的潜在可扩展性。”

目前，本次立体 DNA 显微镜可以获得 24hpf 斑马鱼胚胎的三维空间基因表达数据，但是仍然还没有实现单细胞分辨率。未来，他们将会持续优化这一技术。

若干年后，如能实现单细胞分辨率，可能产生潜在的应用有：

• 首先，目前立体 DNA 显微镜仅能获得三维空间转录组信息，但是由于该技术有很好的可扩展性，因此未来有望实现空间基因组、空间蛋白组、空间 ATAC-seq 等三维空间多组学以及三维时空组信息的检测；
• 其次，本次成果可以提高检测肿瘤微环境的维度，确定完整组织中与癌细胞相互作用的免疫细胞类型，发现新的肿瘤浸润免疫细胞；
• 再次，可以解析胚胎发育过程中细胞之间的相互作用，进而发掘决定细胞命运的关键微环境组分；
• 最后，可以与电子显微镜互补，绘制大脑的连接组。

开发立体 DNA 显微镜，解决现有空间转录组技术的局限性

在开展本次研究之前，钱年超主要研究发育和病毒感染过程中膜蛋白的功能和分子机制。在研究膜蛋白的分子机制过程中，钱年超发现他所研究的三种膜蛋白 TRIC-B、TRPM7 和 TMEM120A 均非独立发挥作用，而是都要与周围的其他蛋白质或者小分子相互作用才能完成一定的功能。这让他意识到在微米甚至纳米层面上，膜蛋白周围环境中的生物分子对其正常功能的重要性。

但是，当时研究单个膜蛋白的分子机制至少需要 2 年，主要原因是当时所用的技术手段太局限。比如，传统的免疫荧光染色和荧光原位杂交等技术，虽然可以定位已知蛋白质、RNA、DNA 等生物大分子，并能根据已有文献和研究者经验去验证可能与它们相互作用的其他分子，然而往往通量较低即一次可检测的分子数量较少，而且只能检测已知目标。使用单细胞转录组技术固然可以高通量地检测单细胞中的 RNA 分子，但是无法确定它们之间的相互作用。

顾名思义，相互作用——就是在空间上接近并互相影响，所以如能获得生物分子的空间信息，就可以在一定程度上推定它们之间的相互作用。2016 年，空间转录组概念被提出之后，空间转录组技术很快就被Nature Methods评为“2020 年年度技术”，至今已经进入快速发展时期。而且随着空间转录组学的发展，肿瘤微环境等方向已经成为生命科学领域的研究热点。

空间转录组技术之所以能够迅速崛起和得到广泛应用，就是因为该技术既可以高通量地检测 RNA 和细胞类型，又可以保留它们在组织内的原位空间信息。它可以为组织样品绘制一张详细的“地图”来展示 RNA 在其中的空间位置，这样就能推测细胞-细胞之间、RNA-RNA 之间的相互作用。钱年超表示：“之所以用‘推测’，没有用‘明确’，是因为目前的空间转录组技术还有很多局限性。”

这些局限性主要是：

• 首先，由于没有单细胞分辨率，因此需要使用复杂的算法来进行细胞分割；
• 其次，只能检测 2D 组织切片，而且由于需要在 2D 平面上标记 RNA 的空间信息，导致现有标记技术都需要把组织强行地像素化。虽然可以把连续 2D 组织切片的空间转录组数据整合成 3D 形式，但是在切片制备的过程中 RNA 难免会丢失或错位，同时数据整合过程也极具挑战性。另外，即使 2D 组织切片也会有一定的厚度，也就是说它并不是纯粹的 2D 平面，所以不同细胞的 RNA 难免会重叠投射到 2D 平面上；
• 再次，需要特殊的仪器设备或试剂，导致应用成本较高。

这些局限性共同限制了该技术的可扩展性和进一步普及。2019 年，美国芝加哥大学教授约书亚·温斯坦（Joshua A. Weinstein）教授和团队（即钱年超目前的合作导师）发表了一篇Cell论文并提出“DNA 显微镜”这一概念。DNA 显微镜是将 RNA 的遗传信息通过聚合酶链式反应（PCR，Polymerase Chain Reaction）来原位扩增并用分子识别码（UMI，Unique Molecular Identifier）标记为 DNA。

随着 PCR 反应的进行，DNA 会以 RNA 为中心向外扩散形成 DNA polonies，然后通过重叠延伸 PCR 将相邻的 DNA polonies 用事件识别码（UEI，Universal Event Identifiers）来串联标记，最后针对所得的串联 DNA 分子进行测序和数据分析，进而重构出 RNA 的相对空间位置。

当时，钱年超正在清华大学做博士后，看到这篇论文时给他的第一印象就是很酷。反复阅读以后，他意识到 DNA 显微镜或许能够克服现有空间转录组技术的缺陷。于是，钱年超申请并加入温斯坦教授团队，希望能把 DNA 显微镜应用到 3D 组织样品中。但是，当时的 DNA 显微镜受到 PCR 条件的限制，因此只能用于 2D 培养细胞中。在和温斯坦教授讨论之后，钱年超决定使用等温扩增方法来替代 PCR，以便能够重新设计 DNA 显微镜。研究中，他和合作者尝试了环介导等温扩增（LAMP，Loop-Mediated Isothermal Amplification）、滚环扩增（RCA，Rolling Circle Amplification）两种等温扩增方法，最后发现 RCA 的效果最好。

基于此，钱年超等人通过展开本次研究，旨在开发立体 DNA 显微镜来解决现有空间转录组技术的局限性，以便实现真正意义上的具有单细胞分辨率的 3D 空间转录组技术，并使用该技术去研究在发育和病毒感染过程中，生物大分子和细胞的空间微环境以及它们的相互作用。

通过 DNA 纳米球来标记 RNA 的空间信息

由于温斯坦教授此前发表的Cell论文仅仅使用 DNA 显微镜检测了培养细胞的甘油醛 - 3 - 磷酸脱氢酶和β- 肌动蛋白的空间分布，并重构了培养细胞的形态。所以，在本次研究的初期，钱年超直接将 DNA 显微镜用于三维组织样品。具体来说，他使用多聚胸苷引物（poly（T），polythymidine）替换了上述Cell论文中所使用的基因特定引物来逆转录 RNA。然后，他进行了 DNA 显微镜的后续操作，借此成功重构出细胞在培养皿中的分布，并构建了它的二维空间转录组。随后，他们使用 DNA 显微镜检测了 24hpf 斑马鱼胚胎的空间转录组，但是所生成的可用于测序的 DNA 产量很低，完全无法用于重构斑马鱼胚胎的形态。

经过反复推敲他们意识到，PCR 过高的变性温度以及快速的升温过程和降温过程，都会影响 PCR 反应在三维胚胎中的顺利进行，也会影响反应产物在样品中的均匀扩散。

如前所述，他们一共尝试了 LAMP 和 RCA 这两种等温扩增方法。由于 LAMP 生成的产物比较复杂，所以他们并未得到较纯的目标 DNA 产物。令人兴奋的是，RCA 能够给出清晰的目标产物。于是，他们围绕 RCA 重新设计了 DNA 显微镜技术，即设计出了立体 DNA 显微镜技术，并对其进行了系统性优化。

最初的实验设计如下：

• 第一，使用 poly（T）原位逆转录 RNA 生成 cDNA；
• 第二，使用 cDNA 的 3 端连接两种 RCA 引物；
• 第三，将含有不同 UMI 的两类单链环状 DNA 退火结合到 RCA 引物；
• 第四，使用滚环扩增方法生成 DNA 纳米球，进而编码 RNA 的空间信息（UMI-cDNA）；
• 第五，由于邻近 DNA 纳米球之间桥联含有 UEI 的 DNA 分子，因此将相邻 DNA 纳米球上的 UMI 拷贝到含 UEI 的 DNA 分子上生成 UMI-UEI-UMI，从而记录 DNA 纳米球的邻近关系；
• 第六，测序 UMI-cDNA 和 UMI-UEI-UMI，并分析测序数据。

以上便是他们的设计雏形，基本原理是通过 DNA 纳米球来标记 RNA 的空间信息，以及通过邻近 DNA 纳米球之间形成桥联分子来标记其邻近关系。

围绕上述设计雏形，他们开始了为期大约一年的优化过程。依托在培养细胞上的便利性，最初钱年超使用培养细胞来对设计中的每一个酶促反应进行优化。他和合作者一般做到 RCA 产生 DNA 纳米球为止，以便确定设计前半段的反应条件。由于在 RCA 反应中加入了荧光色素标记的 dUTP，因此所产生的 DNA 纳米球会带有荧光。经过 RCA 反应之后，在荧光显微镜之下，通过检测荧光信号的强弱就可以判断反应条件的好坏。

完成前半段的反应条件优化后，钱年超开始进行端到端的实验，由于他已经知道 UMI-cDNA 和 UMI-UEI-UMI 这些预期产物的片段大小，因此通过琼脂糖凝胶电泳来检测端到端实验的产物，就可以基本确定反应条件的好坏。然后，通过进一步测序和分析测序数据，就可以定量产物的多少。

通过使用培养细胞将实验条件优化之后，接下来钱年超转向了用受精后 24 小时（24hpf）斑马鱼胚胎做基准测试。因为斑马鱼胚胎很容易大量获取，也是研究早期胚胎发育的有力模型，以及基于培养细胞与三维斑马鱼胚胎在细胞数量、试剂通透性等方面的差异，钱年超用斑马鱼胚胎又进行了为期一年左右的优化实验。这时，他终于可以用测序数据重构斑马鱼胚胎的三维形态。

UMI-UEI-UMI 的产量决定了形态重构的成功与否。但是，他得到的 UMI-cDNA 产量依然很低，因为 24hpf 斑马鱼胚胎有大概 25,000 以上的细胞，每个细胞检测 400 个不同 UMI-cDNA，就需要 1,000 万个 UMI-cDNA。为了解决这一挑战，钱年超又进一步优化了实验条件，主要通过引入了“DNA 纳米球降解”和“体外转录”这两个核心策略。其表示，DNA 纳米球降解可为后续酶反应释放纳米球所占的空间，方便酶促反应的组分扩散；体外转录可以增加产物的拷贝数，减少丢失产物的风险。

经过精心的实验设计和多轮的实验条件优化，他最终成功地开发出了立体 DNA 显微镜，目前可以构建 24hpf 斑马鱼胚胎的三维空间转录组。

日前，相关论文以《使用立体 DNA 显微镜对完整生物进行空间转录组成像》（Spatial transcriptomic imaging of an intact organism using volumetric DNA microscopy）为题发表在Nature Biotechnology[1]，钱年超是第一作者，约书亚·温斯坦（Joshua A. Weinstein）担任通讯作者。

参考资料：

1.Qian, N., Weinstein, J.A. Spatial transcriptomic imaging of an intact organism using volumetric DNA microscopy.Nat Biotechnol(2025). https://doi.org/10.1038/s41587-025-02613-z

运营/排版：何晨龙