清华团队开发蛋白定向进化超级加速器，1天实现数月迭代进化效果

科学家按下基因进化的“超级加速键”，过去自然界中需要数万年甚至更久的基因突变和进化过程，现在只需要 1 天就能完成了。

最近，清华大学陈国强教授团队开发了一种突破性的定向进化技术——“正交转录突变系统”（orthogonal transcription mutation system）。该系统能够加速对目标基因的进化过程，具有突变效率高、特异性高、突变范围广、宿主兼容性强和使用简便的特点。

值得关注的是，该系统在非模式生物中突变率提升超过 150 万倍。研究人员应用该系统在单日诱变周期内快速进化了荧光蛋白、色素蛋白、细胞骨架蛋白、细胞分裂相关蛋白、全局转录因子及 LysE 转运蛋白。这意味着，原本需要数周甚至数月迭代进化才能获得的理想效果，现在仅需 1 天即可实现。

通过将脱氨酶与噬菌体 RNA 聚合酶融合，该系统能够在目标基因中均匀引入 C：G 到 T：A 和 A：T 到 G：C 的突变，同时保持较低的脱靶效应。研究团队对该工具的特异性进行检测，发现它能够针对特定的目标基因产生高频突变，对其他基因的干扰很小，从而保证了高特异性。

多个基因测试结果显示，该系统在超过几千个碱基对的长度上也能产生大量突变，展现出广泛的突变范围。此外，该系统实现了兼容不同生物体系——不仅适用于大肠杆菌为代表的模式生物，也适用于以嗜盐单胞菌 Halomonas bluephagenesis 为代表的极端微生物。

在基础研究领域，该系统为蛋白质功能研究提供了全新的工具。它不仅能快速鉴定关键氨基酸位点、解析催化机制，更重要的是可以建立蛋白质进化过程中序列与功能之间的映射关系，从而加速对蛋白质进化机制的理解。

在工业应用方面，该系统展现出广阔的前景。首先，在药物研发领域，可对制药相关蛋白、酶或抗体进行高效突变，既能加速药物生产流程，又能优化抗体功能。其次，在绿色生物制造方面，通过改造微生物对纤维素水解液、乙酸等非常规碳源的利用基因，可显著提高资源利用效率。更重要的是，该系统能大幅提升工业酶的催化活性，从而优化整个生产流程的效率。

目前，该团队已与合成生物学公司微构工场合作，利用正交转录突变系统对聚羟基脂肪酸酯（PHA，Polyhydroxyalkanoates）合成的关键基因进行突变和进化，旨在通过提高 PHA 的合成效率，为 PHA 工业放大生产奠定基础。

审稿人对该研究评价称：“总体而言，这项研究基于 MmP1、K1F 和 VP4 RNA 聚合酶建立了正交转录介导的连续进化系统。该研究设计严谨、方法可靠，为构建高效生物催化系统提供了切实可行的解决方案。”

近日，相关论文以《一种用于加速体内蛋白质进化的正交转录突变系统，可产生所有转换突变》（An orthogonal transcription mutation system generating all transition mutations for accelerated protein evolution in vivo）为题发表在Nature Communications[1]。清华大学博士生邵明威是第一作者，陈国强教授担任通讯作者。

理想的“五合一”蛋白进化系统：效率高、特异性高、突变范围广、宿主兼容性强和使用简便

蛋白质的进化和优化在生物制药、工业生物技术和合成生物学等领域具有重要意义。然而，传统蛋白进化方法在效率、宿主兼容性或突变范围大小等方面存在局限性，特别对于盐单胞菌这种非模式生物而言，目前仍然缺乏高效优化蛋白质功能的工具。

首先，体外突变方法（如易错 PCR 等）虽然能够构建突变体文库，但整个过程周期较长，通常需要数周甚至数个月才能完成文库构建和宿主细胞转化。此外，这类方法严重依赖转化效率，尤其是当目标 DNA 片段较大时，转化效率会大幅下降，这会导致最终导入宿主细胞的突变体数量有限，从而降低筛选到目标突变体的概率。

其次，现有的体内进化方法虽然避免了体外转化的限制，但仍存在诸多不足。例如，美国哈佛大学刘如谦教授实验室开发的噬菌体辅助连续进化系统（PACE）虽然高效，但系统搭建复杂，且仅适用于特定蛋白质的进化。

类似地，基于正交 DNA 复制的突变系统通常局限于特定宿主，难以迁移至新其他宿主中；而基于 T7 RNA 聚合酶的突变工具在非模式生物（如假单胞菌、嗜盐单胞菌）中效率较低，甚至完全失效。此外，基于 CRISPR-Cas 的突变系统通常仅能在特定位点引入突变，无法覆盖整个基因或基因簇。

基于这些挑战，研究团队认为，一个理想的蛋白进化系统应具备以下特点：首先，突变效率高，能够在短时间内完成突变过程；其次，突变特异性高，仅针对目标基因产生突变，不影响其他基因的功能；第三，突变范围广，能够覆盖整个目标基因或基因簇，而不仅仅局限于单个碱基；第四，宿主兼容性强，能够在不同宿主细胞（包括模式和非模式生物）中使用，具有广泛的兼容性；最后，使用简便，无需复杂的仪器设备即可完成突变进化。

核心机制：脱氨酶融合噬菌体 RNA 聚合酶实现精准突变

正交转录突变系统的核心在于，将 MmP1、K1F 和 VP4 这三种本身具有广宿主兼容性的噬菌体 RNA 聚合酶与脱氨酶进行融合。

这一巧妙设计实现了两个关键功能的协同作用：RNA 聚合酶主要负责识别对应的启动子，进而启动下游基因的转录过程，此时双链 DNA 会解旋成单链；脱氨酶可以对暴露的单链 DNA 区域进行突变，通过组合不同类型的脱氨酶可实现 C：G 到 T：A 和 A：T 到 G：C 两种碱基突变。

实验显示，产生 C：G 到 T：A 突变的 pMT2-MmP1-W 突变效率比对照组提高 150 万倍，而 pMT23opt-MmP1 可同时引入 C：G 到 T：A 和 A：T 到 G：C 突变，日均突变率达 2.64 次/千碱基，远超此前技术。

邵明威对 DeepTech 解释说道：“该系统的优势体现在精准可控，当转录过程终止时突变也会同步停止，从而保证了对特定基因和区域的突变。并且，这种基于噬菌体 RNA 聚合酶与启动子特异性识别的机制，赋予了系统极高的突变特异性。”

在构建双类型突变系统的过程中，研究团队采用了三种不同的设计策略。首先，针对两种功能不同的脱氨酶（胞嘧啶脱氨酶可产生 C：G 到 T：A 类型的突变；腺嘌呤脱氨酶则能产生 A：T 到 G：C 类型的突变），他们设计了两种融合顺序相反的突变系统：一种采用“胞嘧啶脱氨酶-腺嘌呤脱氨酶-RNA 聚合酶”的串联结构，另一种则采用“腺嘌呤脱氨酶-胞嘧啶脱氨酶-RNA 聚合酶”相反顺序。

此外，他们还开发了第三种系统——在单个质粒中同时表达“腺嘌呤脱氨酶-RNA 聚合酶”和“胞嘧啶脱氨酶-RNA 聚合酶”突变元件。

“在构建第三种突变系统的过程中，我们对其中一个 RNA 聚合酶的序列进行了密码子优化，这样能够有效避免因 RNA 聚合酶基因序列高度相似而导致的同源重组问题。”邵明威说。

这项历时近三年的研究过程充满了挑战。都说“万事开头难”，研究初期在构建突变检测系统时就遇到了长达半年的瓶颈期。该团队最初尝试在嗜盐单胞菌中将脱氨酶与 RNA 聚合酶融合来验证概念可行性，但如何准确评估突变效率成为关键难题。

常规的抗生素抗性基因检测方法在实验使用的非模式菌株（嗜盐单胞菌）中面临重大挑战——该菌株天然对卡那霉素、氨苄霉素和链霉素等多种抗生素具有抗性。

为此，研究人员在前期构建突变检测系统时，筛选了大量候选抗生素与抗性基因。邵明威表示：“经过不断筛选，与陈国强老师交流以及和实验室其他同学讨论，我们最终发现基于红霉素抗性基因是有效的检测方案。”

研究过程中遇到的另外一个难题是突变在目标基因上分布不均匀。在系统优化阶段，研究人员发现突变存在明显的区域偏好性，主要集中在启动子附近区域，这种不均匀分布严重影响了蛋白质的全面优化。

通过大量文献调研和深入思考，邵明威尝试通过在目标基因的上下游同时插入招募突变系统的启动子。这一改进使突变数目显著增加，且分布更加均匀。“在技术瓶颈期持续探索后，突然找到解决方案的那一刻，有种豁然开朗的感觉。”邵明威回忆道。

计划 1 年内落地产业化，推动绿色生物制造

陈国强教授是中国首位获得国际代谢工程奖的合成生物学专家，其团队长期致力于合成生物学和微生物代谢工程研究，尤其专注于利用合成生物学技术对极端微生物盐单胞菌（Halomonas）进行系统性遗传改造。

盐单胞菌作为一类从高盐环境（2.5M NaCl）中分离鉴定的特殊微生物，具有耐盐碱、抗污染等独特的极端环境适应特性。基于这些特性，该团队在国际上创新性地提出了“以盐单胞菌为底盘细胞的下一代工业生物技术”发展战略。

该技术路线包含三个关键环节——开发高效的蛋白质定向进化工具，重构代谢网络以及优化发酵控制参数，最终目标是实现 PHA、四氢嘧啶、重组蛋白等高附加值生物产品的规模化生产。

在具体实施过程中，他们特别重视关键功能基因的定向进化，例如通过对 PHA 合成酶基因簇的系统性优化，显著提升其催化效率和底物利用范围等核心性能指标，从而大幅提高了目标产物的产量和品质。

嗜盐菌作为“下一代工业生物技术”核心底盘，可在开放无灭菌条件下低成本生产 PHA、四氢嘧啶等高值产物，但此前缺乏高效的蛋白质定向进化工具。团队在本次研究中开发的正交转录突变系统具有显著的模块化和可扩展性特征。该系统可灵活应用于任何目标基因的改造。举例来说，在生物制造过程中，若发现某个关键酶的活性不足导致产物产量受限，即可利用该系统对相关酶进行快速突变优化。

在技术转化方面，陈国强此前还联合发起成立了合成生物学企业微构工场。该公司是一家在生物制造前沿领域极具创新影响力的科技公司，通过嗜盐微生物的改造和工程化应用，进行绿色高分子生物材料 PHA 的研发和制造。

此次关于正交转录突变系统的研究成果，与 PHA 材料密切相关。该系统可高效优化参与 PHA 合成的关键酶，提升其活性和稳定性，从而提高 PHA 的产量和质量。

同时，通过改造生产 PHA 的微生物菌株，增强其合成能力，有望降低成本并拓展 PHA 在生物可降解塑料和医用材料等领域的应用，为 PHA 材料的高效生产提供了有力支持。

目前，实验室正与微构工场开展深度合作，预计经过实验室小规模验证后，计划在 1 年内推进研究成果的工业化放大。得益于微构工场完备的发酵设备体系（从实验室规模的几升发酵罐到工业化生产的数百乃至上千升发酵系统），实验室研发的高活性蛋白质突变体或优化菌株可直接进行规模化生产验证，实现从基础研究到产业应用的快速转化。

值得注意的是，在微生物突变筛选的初期阶段，并不需要进行大规模发酵，仅需几十毫升的培养瓶即可开展工作。由于细菌培养密度极高（>10⁹ cells/mL），几毫升摇瓶培养就能构建大规模的突变体文库并进行高效筛选，待获得理想突变体后再进行放大验证。

针对放大过程中可能面临的发酵稳定性问题，团队认为可将优化后的突变基因整合到细菌染色体上。这种染色体整合策略有效避免了传统质粒系统（依赖抗生素维持且易丢失）的缺陷，确保了工业化生产的稳定性。具体操作流程包括：先将突变基因整合至染色体，再进行发酵验证和规模化生产。

在接下来的研究中，他们计划在技术和应用层面同时推进。首次，将尝试整合其他类型的脱氨酶，来进一步丰富突变数据库的多样性。其次，还将探索这套系统在其他宿主细胞中的兼容性和适用性。在应用层面，研究团队打算利用该系统来加速生物制造中关键酶的优化，以及推动其他重要生物分子的生产。通过优化这些关键酶，助力生物绿色生物经济的发展进程。

参考资料：

1.Shao, M., Zhang, Z., Jin, X. et al. An orthogonal transcription mutation system generating all transition mutations for accelerated protein evolution in vivo.Nature Communications16, 6041 (2025). https://doi.org/10.1038/s41467-025-61354-4

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