Kirkstall Quasi Vivo脑-肠类器官串联互作，逆转胃肠道动力障碍

胃肠道运动障碍是一类常见的疾病，包括食管失弛缓症、胃轻瘫、肠假性梗阻和慢性便秘等。这些疾病通常与肠道神经系统（ENS）中抑制性NO产生运动神经元的功能障碍有关。由于缺乏有效的治疗方法，这些疾病对患者的生活质量造成了严重影响。

利用hPSCs开发一个能够模拟人类ENS的体外模型，包括二维（2D）ENS培养和三维（3D）神经节类器官。这些模型不仅能够模拟ENS的发育过程，还能用于药物筛选和再生医学应用。通过单细胞RNA测序技术，详细分析NO神经元的分子特征，并通过高通量小分子筛选，发现了能够调节NO神经元活性的药物。

Kirkstall Quasi Vivo®类器官串联芯片3D动态培养系统

（一）构建能够模拟人类肠神经系统发育和功能的3D肠神经节类器官模型。这些模型不仅能够用于研究肠神经系统的发育机制，还可以用于药物筛选和再生医学研究。

1. hPSCs的培养和维持

- 使用hESC（人类胚胎干细胞）系H9（WA09-WiCell）或iPSC（诱导多能干细胞）系WTC-11。

- hPSCs在Geltrex包被的培养皿中培养，使用E8培养基进行维持。

- 每30天检测一次支原体污染。

2. ENCC（肠神经嵴细胞）的诱导

- 当hPSCs单层培养达到约70%汇合时，开始12天的ENCC诱导方案。

- 第0天：吸去E8培养基，替换为神经嵴诱导培养基A（含有BMP4、SB431542和CHIR 99021的Essential 6培养基）。

- 第2天和第4天：使用神经嵴诱导培养基B（含有SB431542和CHIR 99021的Essential 6培养基）。

- 第6天、第8天和第10天：使用培养基C（培养基B中加入视黄酸）。

- 第12天：吸去培养基C，用Accutase处理ENCC单层细胞（30分钟，37°C，5% CO₂），离心后将ENCC重悬于NC-C培养基（含有FGF2、CHIR 99021、N2补充剂、B27补充剂、Glutagro和MEM NEAAs的Neurobasal培养基）中，转移到超低吸附板中形成自由悬浮的3D肠神经嵴球体（enteric crestospheres）。

3. 肠神经元的诱导

- 第15天：将肠神经嵴球体聚集到孔中心，移除NC-C培养基，根据最终培养布局（2D ENS培养或3D肠神经节类器官）进行不同处理。

- 对于3D肠神经节类器官：

- 避免使用Accutase处理，直接向肠神经嵴球体中加入相同体积的肠神经元培养基（含有GDNF、抗坏血酸、N2补充剂、B27补充剂、Glutagro和MEM NEAAs的Neurobasal培养基）。

- 每隔一天更换一次肠神经元培养基，直到第30-40天，之后可以减少更换频率，但需增加更换培养基的量。

4. 3D肠神经节类器官的培养和维护

- 在第15天之后，肠神经嵴球体在肠神经元培养基中继续培养，逐渐分化为肠神经节类器官。

- 培养过程中，每隔一天更换一次培养基，直到第30-40天。

- 从第40天开始，可以减少更换培养基的频率，但需增加每次更换的培养基量，以维持类器官的长期培养。

5. 功能验证和分析

- 免疫荧光染色：用于检测神经元和胶质细胞标记物的表达，验证类器官中不同细胞类型的形成。

- 单细胞RNA测序：用于分析类器官中细胞类型的分子特征，鉴定NO神经元等特定亚型。

- 钙成像和电生理记录：用于评估神经元的活性和功能成熟度。

- 药物筛选和功能测试：通过高通量筛选，鉴定能够调节NO神经元活性的化合物，并在体外和体内模型中验证其功能。

（二）在进行类器官传代时，需要注意以下几个关键事项

1. 传代前的准备

- 培养基准备：确保使用适合类器官生长的培养基，如含有特定生长因子和信号分子的培养基。对于肠类器官，可以使用成熟商业化类器官生长培养基。

- 基质准备：使用适合的细胞外基质材料，如Matrigel，以支持类器官的三维结构。

- 工具和材料准备：准备好所有需要的工具和材料，如温和细胞解离试剂、离心管、移液枪头等，并确保它们处于适当温度（如4°C或室温）。

2. 类器官的处理

- 观察和评估：在显微镜下观察类器官，确保其健康状态良好。

- 温和解离：使用温和的细胞解离试剂（如TrypLE或Gentle Cell Dissociation Reagent）来解离类器官，避免对细胞造成损伤。

- 避免过度解离：解离时间不宜过长，以免损伤细胞。对于小鼠肠类器官，室温下孵育1分钟即可。

3. 离心和重悬

- 离心条件：以适当的离心力（如290×g，4°C，5分钟）离心，以收集类器官。

- 重悬：使用预冷的培养基或基质重悬类器官，避免产生气泡。

4. 接种和培养

- 基质和类器官混合：将类器官与Matrigel等基质混合后，快速接种到培养板中，形成凝固的dome。

- 培养条件：确保培养板在37°C、5% CO₂的条件下培养，以促进Matrigel的凝固和类器官的生长。

- 避免直接接触：加入培养基时，应避免直接冲击dome，以免破坏其结构。

5. 培养后的维护

- 定期换液：每周进行三次完全换液，以维持类器官的生长。

- 监控生长：定期观察类器官的生长情况，确保其健康和正常发育。

- 传代比例：根据类器官的生长速度，选择合适的传代比例（如1:2至1:6）。

6. 其他注意事项

- 传代频率：根据类器官的生长情况，定期进行传代，通常每7至10天进行一次。

- 冷冻保存：在长期培养过程中，可以将类器官进行冷冻保存，以便后续使用。

- 基因稳定性：长时间传代可能导致类器官的基因稳定性发生变化，因此需要定期进行基因检测。

（三）展望：结合Kirkstall Quasi Vivo类器官串联芯片动态培养构建系统，确保3D肠-脑类器官的长期培养

1. 优化培养基和灌流条件

- 培养基成分：使用适合肠神经节类器官的培养基，如含有GDNF、抗坏血酸、N2补充剂、B27补充剂、Glutagro和MEM NEAAs的Neurobasal培养基。此外，可以参考其他研究中使用的培养基成分，如添加RSPO1、EGF、PGE2等，这些成分对于维持肠干细胞的增殖和功能至关重要。

- 灌流参数：通过Kirkstall Quasi Vivo系统 精确控制灌流参数，如流速、流量等，确保类器官之间的物质交换和信号传递接近体内真实生理状态。

2. 模拟体内微环境

- 细胞外基质（ECM）：使用适合的基质材料，如Matrigel，来模拟体内细胞外基质环境。Matrigel是一种常用的基质，能够提供必要的细胞外基质蛋白，支持类器官的三维结构和功能。

- 动态灌流：利用Kirkstall Quasi Vivo系统的动态灌流功能，模拟体内血液循环和组织间液流动，为类器官提供持续的营养供应和废物清除。

3. 定期传代和监测

- 传代频率：根据类器官的生长情况，定期进行传代，通常每7天进行一次。传代时，可以使用温和的细胞解离试剂，如TrypLE，将类器官分解成较小的片段或单细胞，然后重新嵌入到新鲜的基质中。

- 监测和评估：定期监测类器官的形态、细胞活性和功能。可以使用钙黄绿素和碘化丙啶双染等方法检测细胞活性。此外，通过免疫荧光染色和单细胞RNA测序等技术，评估类器官中不同细胞类型的形成和功能。

4. 利用微流控技术促进细胞间相互作用

- 细胞间信号传递：通过Kirkstall Quasi Vivo系统的微流控通道，连接不同的类器官模块，模拟体内细胞间的信号传递。例如，可以将肠神经节类器官与肠道类器官连接，研究神经信号对肠道功能的调控。

- 模拟生理剪切应力：利用微流控设备产生的剪切应力，模拟体内肠道的机械运动，促进类器官的功能成熟。

5. 长期培养的优化

- 冷冻保存：在长期培养过程中，可以将类器官进行冷冻保存，以便后续使用。这有助于保持类器官的基因稳定性和功能特性。

- 基因编辑和标记：利用基因编辑技术（如CRISPR-Cas9）对类器官进行标记或功能改造，以便更好地研究其在长期培养中的变化。

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