分子胶研究“双子星”：探索HTRF/Lance和Alpha技术

分子胶（Molecular Glue）是一类靶向蛋白降解（TPD）的小分子化合物，通过促进E3连接酶与新底物间的相互作用，触发泛素-蛋白酶系统，精准诱导靶蛋白降解。与蛋白降解靶向嵌合体（PROTAC）技术相比，分子胶具有分子量小、成药性高、脱靶效应低等优势[1]。

目前，FDA批准的来那度胺和泊马度胺等分子胶药物，在抗肿瘤、免疫调节等领域疗效显著，惠及数百万患者并创造数百亿美元收入[2]。然而，分子胶研发仍面临挑战，如发现过程缺乏系统性筛选方法，靶点确认和机制研究耗资巨大，限制了其进一步发展。

图1. 分子胶作用原理[1]

随着高通量筛选技术的不断发展，分子胶有望在生物验证、靶点确认和机制研究领域取得更多突破性进展。HTRF/Lance和Alpha技术具有均相免洗、操作简单高效、信号稳定、灵敏度高、适用于高通量检测等优势，已被广泛用于潜在分子胶靶标和效应蛋白之间亲和力的验证。

Lance及Alpha技术在分子内二价胶亲和力测定中的应用

BRD4在多种癌细胞中过表达, 在癌细胞的迁移、代谢和恶性发展中发挥重要作用。BRD4作为溴结构域和末端外结构域 (BET) 家族的成员，其特征在于具有两个串联溴结构域（BD1、BD2）。最近的一项专利描述了一种分子内二价胶的降解剂IBG1。IBG1能够结合BRD4的两个串联溴结构域，并将BRD4结合到DCAF16（Cullin RING E3 泛素连接酶）上，从而诱导BRD4的降解。

为了在生化水平验证IBG1与BRD4和DCAF16的结合结构域，Oliver等[3]使用Lance Anti-His-Eu、His-BRD4及Cy5标记的DCAF16测定三元复合物的形成，他们发现IBG1能增强BRD4Tandem*和DCAF16之间的相互作用，而非通过单一BD1或BD2结构域（图2b,c）。

图2. IBG1增强BRD4 Tandem结构域和DCAF16之间的相互作用[3]

* Tandem: BRD4包含两个溴结构域（BD1 和 BD2）的构建体

*JQ1: BET 家族溴结构域抑制剂

随后，他们使用biotinylated-JQ1*, SA-Donor beads, His-BRD4, Nickel Chelate Acceptor beads，构建AlphaLISA displacement实验（图2e），验证IBG1竞争性结合BRD4的能力。

实验发现三元复合物BRD4Tandem: IBG1: DCAF16的亲和力显着强于BRD4BD1: IBG1: DCAF16，进一步证实了两个溴结构域对于复合物形成都是必需的。总之，Lance及Alpha的实验确立了IBG1能够增强BRD4和DCAF16的亲和力，并且需要BRD4两个溴结构域的存在。

HTRF技术在分子胶亲和力测定中的应用

SMAD4是TGF-β通路的核心介质，在TGF-β的刺激下，SMAD4与SMAD3等形成复合物，将信号从细胞外传递至细胞核，调控基因表达。SMAD4R361H突变是多种肿瘤中的常见突变，会损害SMAD4和SMAD3之间的相互作用，从而阻断TGF-β诱导的抗增殖信号传导。

为了检测Ro-31-8220和Go-6983对His-SMAD4/SMAD4 R361H和Flag-SMAD3的相互作用的影响，Cong Tang等[4]使用HTRF Anti-FLAG-Tb Donor及Anti-His-d2 Acceptor构建了灵敏且可扩展的高通量筛选平台。Ro-31-8220和Go-6983被鉴定为分子胶，可诱导SMAD4 R361H/SMAD3的相互作用。

图3. Ro-31-8220和Go-6983被鉴定为分子胶诱导SMAD4 R361H/SMAD3的相互作用[4]

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参考文献

[1] Zhao L, et al. Targeted protein degradation: mechanisms, strategies and application. Signal Transduct Target Ther. 2022 Apr 4;7(1):113.

[2] Dewey JA, et al. Molecular Glue Discovery: Current and Future Approaches. J Med Chem. 2023 Jul 27;66(14):9278-9296.

[3] Hsia O, et al. Targeted protein degradation via intramolecular bivalent glues. Nature. 2024 Mar;627(8002):204-211.

[4] Tang C, et al. Hypomorph mutation-directed small-molecule protein-protein interaction inducers to restore mutant SMAD4-suppressed TGF-β signaling. Cell Chem Biol. 2021 May 20;28(5):636-647.e5.

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