Nature Plants | 巫永睿/张余/王文琴联合揭示植物质体DNA复制中切除RNA引物的关键核酸酶及其作用机制

202 5 年 6 月 25 日，中国科学院分子植物科学卓越创新中心巫永睿团队 联合本中心张余团队以及上海师范大学王文琴团队 在NaturePlants上发表了题为 “PEN1catalysesRNA primer removal during plastid DNA replication in maize”的研究论文。 科研人员经过八年不懈探索，揭示了植物质体 DNA （ p tDNA ） 复制 体 中RNA引物切除的核心核酸酶组分plastid-localized and Mn2+-dependent 5’-3’exonuclease1( PEN1 )。 长期以来，植物 p tDNA 复制中负责RNA引物切除的核酸酶一直未被鉴定 到 ，而PEN1的发现填补了这一关键 领域 的空缺， 完善了 p tDNA 复制 理论。

DNA复制是生命科学的核心基础问题之一。双链DNA解旋后引物酶在模板链上合成RNA引物。前导链仅需 合成 一个RNA引物即可由 高持续 合成能力的DNA聚合酶实现连续延伸，而 滞后链则需 合成 多个RNA引物，通过不连续的冈崎片段合成方式完成复制 。 D NA 复制后，R NA 引物 由核酸酶 负责 切除 ，从而保证基因组的完整性。在原核生物中，如大肠杆菌， DNA聚合酶III是主要负责DNA复制的聚合酶，而DNA聚合酶I是负责切除RNA引物的酶。DNA聚合酶I除了具有聚合酶活性外，还具5′ - 3′外切酶活性。DNA聚合酶I在延伸DNA链时，同步利用其外切酶活性切除RNA引物，这 一 过程称为缺口翻译（Nick translation）。

在 内共生过程中，光合蓝 细菌 被非光合真核生物整合 共生 ，最终演变成了质体。质体 根据 其形态和功能的差异，主要分为叶绿体、淀粉体和有色体 等 ，它们分别在光合作用、淀粉合成和代谢调控中扮演着关键角色。尽管功能各异，但所有质体都起源于共同的前体 （前 质体 ） ，并 具有 相同的 遗传物质 。 质体是半自主的细胞器 ， Pol1A和 1 B负责 p tDNA 的复制； 然而， 其 缺乏 DNA聚合酶I 类似 的 5 ’ -3 ’ 外切酶结构域 。因此，负责 p t D NA 复制 过程 RNA引物 切除 的 核酸 酶的身份，长期以来一直是一个未解之谜。 拟南 芥 中，AtRNH1 C 可能参与 RNA引物 切除 ；然而 ， 这一过程并非完全高效， AtRNH1C 切割后 会在RNA-DNA连接处 残留 1-3个 核糖核苷酸 ， 从而抑制 DNA片段的连接 。因此，研究人员推测还需要其他尚未被鉴定的质体定位的核酸酶来完全切除RNA引物并允许DNA片段连接，从而确保ptDNA复制的成功完成。

2017年， 刚进实验室的研究生 黄兴和 导师 巫 永睿 研究员 在山东泰安的夏季试验田里，从 甲基磺酸乙酯 （EMS）诱变群体分离 到 pen1 突变体。与之前报道的在世代间表现出稳定 遗传 表型的 籽粒 突变体不同， p en1 胚乳发育和 灌浆 存在缺陷，且 随着世代繁衍 加剧的特征。值得注意的是， pen1 /+ 自交分离的纯合突变体（ p en1 F2 ）的胚乳质体发育仅 伴随 轻微缺陷，而 p en1 F2 继续自交后代（ p en1 F 3 ） 的 胚乳前质体均不能正常分化 ，胚乳表现为完全空壳（图1） 。

图1：PEN1调控质体发育

研究人员 成功 分离了 Pe n1 位点 ，发现其编码质体 特异定位 的5 ’ -3 ’ 外切酶。PEN1与 p t DNA 复制 体 的其他成分（Pol1A/1B和 连接酶 LIG1） 共定位于 叶绿体 拟核 。研究表明，PEN1能高效切割RNA引物 切 除过程中间体 ，并 完全移除 RNA-DNA连接处 的 核糖核苷 酸，从而促进了LIG1的连接。 研究人员 成功 在体外重建了由PEN1、Pol1A/1B和LIG1 介 导的质体RNA引物去除过程 ， 证实P EN1 的确参与了 pt DNA 复制过程 R NA 引物移除 （图2） 。

图2：PEN1参与ptDNA复制RNA引物移除

此外， 研究人员 还解析了PEN1-双链DNA二元复合物的晶体结构 。 在 PEN1的催化中心，被切割DNA链的第1个核苷酸的5 ’ 单磷酸基团与活性中心的Mg2+形成配位键、连接第2和第3个核苷酸的磷酸二酯键同时与K250、R264、R283形成三个盐桥，这使得被切割DNA链在活性中心的相对位置被固定，从而使PEN1精确切割1和第2个核苷酸之间的磷酸二酯键，发挥其核酸外切酶活性 。为了探究 P en1 突变对 p t DNA 的影响， 研究人员 通过分离 p tDNA 和De tail-Seq 发现 Pen1 功能缺失 直接导致 p t DNA 的 断裂， 且 断点 主要积累在 p tDNA 正义 链上。 同时 ， 研究人员还发现 Pen1 功能缺失抑制了 p t DNA 的复制和转录 活性 ，从而影响了质体的正常发育和功能 （图3） 。

图3：PEN1对于维持ptDNA的完整性至关重要

对质体遗传和复制机制的系统性阐述，对于理解质体发育和推动植物遗传工程至关重要。尽管已鉴定出越来越多参与ptDNA复制的因子，但负责移除RNA引物的特定组分一直不明确。该研究鉴定到的质体特异性的5’-3’外切酶PEN1能直接催化质体DNA复制过程中RNA引物的移除，并阐明了其结构基础。这些发现为质体复制（尤其是RNA引物移除过程）提供了深刻的见解，助于推动作物改良的质体遗传工程进展。

中国科学院分子植物科学卓越创新中心 博士后黄兴，博士生石国龙以及已毕业 博士肖俏（现安徽农业大学博士后） 为本研究论文 的 共同第一作者，巫永睿和张余研究员 以及上海师范大学王文琴教授 为 通讯作者 。 四川农业大学黄永财教授，上海师范 大学研究生冯娇娇等参与了该研究。 清华大学生命科学学院植物生物学研究中心孙前文 副教授和张卫峰博士在 p t D NA 损伤检测 提供了大量帮助。该 研究 工作得到了 科技部 重点研发计划 、 国家 自然科学基金 重点和青A延续， 中国科学院 先 导 B ， 尚思探索学者和 国家资助博士后B类 等 项目的资助。

论文链接：

https://www.nature.com/articles/s41477-025-02027-4

巫永睿研究团队长期聚焦于玉米高蛋白形成 调控 和胚乳发育 关键关键 基因的克隆和机理解析 。在 Nature, Nature Communications, Nature Plants, PNAS, The Plant Cell等杂志上发表 高水平论文 60余篇。2014年获得基金委优秀青年基金资助，2018年入选科技部中青年科技创新领军人才，2019年获得国家杰出青年基金资助，2021年入选“中国科学院优秀研究生导师”，2023年获“科学探索奖”，2024年获“尚思探索学者” ，2 025 年获青 年科学基金项目（A类）延续资助 。 现 公开 招聘博士后2 - 4 名 。详情请参见 :

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