Nature子刊突破！孔径匹配型嵌段共聚物膜打造酶促连续流反应器，30天内实现生产力2147mol/m²

利用固定化酶的连续流生物催化成为一种可持续的化学合成途径。然而，由于非生产酶固定或酶载体尺寸不匹配导致的电流反应器生物催化效率不足，阻碍了其广泛应用。在这里，我们展示了一种通用的、稳健的方法，通过将精心设计的可伸缩的等孔嵌段共聚物(BCP)膜作为载体，利用材料结合肽(MBP)定向和高效固定，来制造高性能的酶催化连续流反应器。精心设计的BCP膜密集排列均匀的酶匹配纳米通道为生产固定化植酸酶提供了所需的纳米限制环境。调整纳米通道的性质可以进一步调节复杂的反应过程，增强催化性能。酶匹配载体和高效酶固定化的协同设计使催化性能优异，具有>1个月的操作稳定性，卓越的生产率和高时空产率(1.05 × 105 g L−1 d−1)。所获得的性能使所设计的纳米和等孔嵌段共聚物膜反应器具有很高的工业应用吸引力。

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固定化酶在连续流中的应用已成为生物催化生产化学品的一种具有吸引力和可持续性的方法，通过提高反应生产率、改善反应控制、扩大效率和下游处理1。虽然酶在固体载体中的固定化有助于酶/产物的分离，但它通常会阻碍底物向酶活性位点的传质2。后者通常可归因于酶大小的差异(通常为4-12 nm)，与通常大几个数量级的载体系统中的孔/腔相比。最近开发的连续流反应器已经配备了小型化的载体空间，通过减少传质距离和增加局部酶浓度3,4,5来解决这一障碍，包括带有微/纳米颗粒6或微胶囊的柱式反应器7,8,9，微流控反应器10，聚合物/阳极氧化铝(AAO)膜反应器11,12。然而，这些系统仍然遇到以下至少一个问题:(i)酶不匹配的载体空间/纳米通道，对于酶进入/固定化来说可能太窄，或者在高传质时对底物到产物的有效转化来说太宽;(ii)载体纳米通道尺寸分布不均匀，在酶分布不均匀和反应条件不可控的情况下，可能导致催化性能不足;(iii)在较小范围内，通过物理吸附和/或化学修饰进行非生产性酶固定或浸出。在这里，为了解决所有这些问题，我们提供了一个通用的和强大的酶流动反应器设计系统，通过精心设计的可伸缩的等孔嵌段共聚物(BCP)膜作为载体，通过基因融合材料结合肽(MBP)定向一步酶固定。MBPs使酶固定具有>80%的高表面覆盖率，而不会影响水溶液在室温下的酶的灵活性/活性。

等孔BCP膜具有有序、均匀、酶匹配的纳米通道(10-100 nm)，高孔数密度(>1014个孔m−2)，因此具有高表面积体积比14,15,16。因此，BCP膜不仅可以作为载体有效地固定/富集蛋白质，具有足够的蛋白质表面覆盖17，还可以确保底物有效地将质量传递到酶的活性位点4,5，并提供精确的反应控制18,19。BCP膜被广泛用作先进的膜分离材料20,21,22,23，从而使催化反应和产物分离集成在一个单元中，并提供可扩展和高效的过程强化。本研究采用蒸发诱导自组装和非溶剂诱导相分离(SNIPS)相结合的方法制备了BCP膜。后一种一步法直接且可扩展，可生产不对称但完整的膜，其具有独特的结构，具有等孔顶层和大孔支撑亚层14。这些特性赋予了BCP膜优越的机械稳健性和可扩展性，而传统的AAO等孔膜具有热稳定性和多步骤工艺12。BCP膜具有较高的孔隙率，孔数密度比径刻等孔膜高2个数量级，因此具有较好的渗透性。此外，调整载流子的纳米通道特性可以根据需要调节反应过程6,26。对于SNIPS BCP膜，纳米通道的尺寸可以减小到10 nm以下，纳米通道的表面性质可以从亲水性调节到疏水性，从中性调节到带电20,27,28,29。因此，SNIPS BCP膜可以系统地在大范围内变化，这使得它们具有高度的适应性，可以克服非特异性酶固定和反应过程的挑战。

MBPs(粘连促进肽或锚定肽)可以依靠非共价多位点相互作用(如静电、疏水、π-π相互作用和氢键)以高亲和力和高效率强结合到各种天然和合成材料表面30,31,32。MBPs与各种生物分子(如酶、蛋白质)的遗传融合导致MBPs -酶融合，可以以定向方式有效地固定在载体13,33,34上。有利定向的酶固定化和MBP与酶之间的间隔螺旋确保了结合酶和催化酶部分的特殊分离，从而保持了催化酶的性质不变13,35。此外，MBPs的结合强度和材料特异性结合可以通过标准的蛋白质工程方法进行调整，以满足应用条件(例如盐、pH、温度、产品/底物或洗涤剂浓度)的要求30,36,37,38。

植酸酶是工业上重要的用于动物营养的酶。植酸酶催化从植物的磷酸盐储存化合物植酸中逐步释放磷酸盐40。从油菜籽和其他植物的植酸盐中回收磷酸盐提供了一条绿色磷酸盐的途径，可以覆盖德国30%的磷肥消耗，并为阻燃多磷酸盐化合物提供了价值增值的机会41,42。高效的植酸水解酶流反应器是循环p经济和高附加值产品如聚磷酸盐的先决条件。

a 3D structure of wild-type phytase (YmPh-WT) and YmPh genetically fused to the MBP LCI (YmPh-LCI). b SEM images of PS-b-P4VP isoporous membranes: top surface and cross-section. c Dose-response curve to analyze binding efficiency of YmPh-WT and YmPh-LCI on isoporous BCP membranes (@M indicates membrane-bound YmPh). Error bars represent s.d. of the mean from three independent experiments (n = 3). AFM height images of dense PS-b-P4VP films (d) treated with buffer solution as a control (Tris-HCl buffer (50 mM, pH 8.0)) and (e) after YmPh-LCI immobilization. f 3D reconstruction image from a z-stack along the cross-section of the membranes with fluorescently labelled YmPh-LCI_Cy3. The membrane’s top layer faces up. g A reconstructed elemental line scan of the gold signal along the cross-section of the membranes with gold-labelled YmPh-LCI_Au from energy-dispersive X-ray spectroscopy (EDX) mapping. The membrane’s top layer faces right. Transmission electron microscopy (TEM) bright-field images of the cross-section of the membranes with YmPh-LCI_Au: (h) low magnification, (i) high magnification. Results were reproduced three times independently; representative micrographs are shown. Source data are provided as a Source Data file.

连续流纳米和等孔膜反应器的性能

我们在死端模式下通过单道过程进行了压力驱动的连续流动反应(流式配置，图3a，补充图12)，并利用YmPh-LCI测定了植酸盐(肌醇-1,2,3,4,5,6-己二磷酸或InsP6)的磷酸(PO43-)的逐步释放。逐步水解可以被认为是一个级联流动反应，其中底物(InsP6)和中间体(低磷酸化肌肌醇，InsP)“碰撞”，并在通过纳米通道的过程中被几种植酸酶水解。我们通过测定渗透液中的磷酸盐浓度(补充图13)、每个InsP6的平均水解量(记为RP)和产率(定义为单位时间内每个膜反应器面积水解InsP6产生的磷酸盐的量)来评估植酸水解性能。此外，植酸盐(InsP6)在从InsP5、InsP4、InsP3、InsP2、InsP1到最后的肌醇的阶梯磷酸水解反应中产生不同的磷脂酰肌醇中间体，并根据磷酸盐的裂解偏好由不同的异构体组成39,45。因此，以不同植酸浓度为参考，测定游离YmPh-LCI的最大催化性能(即RP)。研究了连续流膜反应器的关键工艺参数，包括通量和InsP6浓度(CInsP6)，这些参数直接决定了通过流动反应器的速度和分子数量。

植酸盐(肌醇-1,2,3,4,5,6-己二磷酸，InsP6)通过YmPh-LCI@M在低/高通量或低/高底物浓度下水解磷酸盐的示意图。示意图的轨迹说明了不同浓度的底物InsP6、中间体(InsP)和产物的液体流的径向和纵向运动。从黄色到紫色的渐变颜色变化说明了InsP6的逐步水解过程。曲线的弯曲度越大，表明在低通量下液体流与纳米通道壁的径向碰撞次数越多。线数增加表示底物浓度增加。箭头尺寸越大，表示在低通量或低底物浓度下RP越高。部分图表改编自参考文献20 (CC BY 4.0 DEED)。b在InsP6浓度(CInsP6)为0.38 mM的连续流反应中，通量对YmPh-LCI@M催化性能(即生产率)的影响。c在最佳通量(~15 L m-2 h-1)下，CInsP6对YmPh-LCI@M催化性能(即RP)的影响。d采用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定不同CInsP6条件下水解样品中InsP中间体的组成。使用InsP1-InsP6标准品(Sigma-Aldrich®植酸溶液)进行校准(绿线)。在标准磷酸盐分析中，InsP1和InsP2的淋洗液峰重叠，因此只能分别定量到InsP3-InsP6 41。e YmPh-LCI@M的储存稳定性:在室温(21-23℃)或4℃下，在NaOAc缓冲液(25mm, pH 5.5)中按储存期归一化。f在YmPh-LCI@M连续流模式下使用不同通量随时间的变化(运行稳定性)。所有误差柱表示三个独立实验(n = 3)的平均值的标准差。

通量决定了底物通过纳米通道的传质速率和底物在膜纳米通道内的停留时间46,47。随着通量从6 L m−2 h−1增加到215 L m−2 h−1,InsP6在膜纳米通道内的停留时间为7.0 × 10−2 ~ 0.2 × 10−2 s，远长于分子径向扩散时间(~2.5 × 10−6 s;详细计算见补充图14、15和补充表4、5)。足够的停留时间(比分子扩散时间高4个数量级)证明了所设计的纳米通道能够使衬底流与纳米通道壁发生强烈的相互作用和碰撞，而不受径向分子扩散的限制。因此，匹配酶和纳米通道的尺寸要求是高性能连续流反应器的先决条件(图3a)。此外，在低通量范围内(6-15 L m−2 h−1)，YmPh-LCI@M性能显示出最大1.89 mM, RP为4.9，磷酸盐释放效率为83%，与非固定化/游离YmPh-LCI的最大催化性能相当(图3b，补充图16)。进一步增加通量至215 L m-2 h-1，由于增加的传质速率(每单位时间将更多底物带入纳米通道)可能提高特定植酸酶活性，从而使生产率急剧提高到272 mmol m-2 h-1的最大值，而它降低到1.26 mM, RP为3.3，磷酸盐释放效率为55%(图3b)。这种下降是由于底物与固定化酶之间的接触时间减少，而不是YmPh-LCI脱落，因为在高压驱动的215 L m−2 h−1的流量后，催化性能几乎完全恢复(图3b中的星点)47。据报道，对于黑芽孢杆菌、地芽孢杆菌和大肠杆菌的植酸酶，在植酸降解过程中水解速率显著降低，导致低InsP中间体(例如≤InsP4)45的积累。我们设计的连续流NaMeR能够以215 L m−2 h−1的高通量在几毫秒内将InsP6水解为InsP3，并具有卓越的效率(图3b，补充图16，补充表6)。这是由于在设计的酶匹配纳米通道中，丰富的局部酶表面浓度和最小的酶-酶/酶-底物距离的协同作用(即纳米限制效应48)。这种协同效应使InsP6能够快速转化，并在纳米通道内产生逐步高的转化InsP中间体的局部浓度梯度;后者确保了高比酶活性，可以将InsP6快速水解为InsP3。所实现的多步骤水解证明了连续流NaMeR可以用于单酶从一步到多步骤的转化反应，因此原则上可以用于多酶级联反应，如果酶可以以特定的方式放置在膜纳米通道内。根据得到的结果，我们建议使用连续流NaMeR，高通量为215 L m−2 h−1，以最大限度地提高生产率，或使用低通量(例如，≤15 L m−2 h−1)，以最大限度地提高一个植酸盐分子的磷酸盐产量。

这张示意图展示了如何调整膜的纳米通道特性——尺寸和表面电荷。利用1,4-二碘丁烷对P4VP成孔块进行季铵盐化，使正电荷沿纳米通道壁面引入。部分图表改编自参考文献20 (CC BY 4.0 DEED)和参考文献29 (CC BY 3.0 DEED)。纳米通道尺寸为-57.5 nm (Pri57)， 44 nm (Pri44)， 30 nm (Pri30)的膜顶表面的b-e SEM图像，以及相对电荷为91%的典型正电荷膜(PC91)的Pri57。结果独立重复三次;有代表性的显微照片如下所示。f正电荷百分率由x射线光电子能谱(XPS)测定。源数据作为源数据文件提供。

不同YmPh-LCI@M固定膜:a Pri57, Pri44和Pri30，在连续流动反应中，CInsP6 = 38.6 mM，通量为6.6-7.9 L m-2 h-1(补充图28)，随时间的变化;(b) Pri57、PC10、PC39、PC73、PC91。c不同YmPh-LCI@M固定膜Pri30、Pri44、Pri57、PC10、PC39、PC73和PC91的稳态产率比较。d、e在7.5 ~ 8.0 L m-2 h-1通量下，CInsP6对PC73和PC91的影响及其RP(补充表10)。f在EDX图谱中标记有金标记的YmPh-LCI_Au，沿着膜(PC91)的横截面重建了金信号的元素线扫描。膜的上表面向右。结果独立重复三次;如下为代表性显微照片。g通过表面等离子体共振(SPR)光谱测定了YmPh-LCI对聚(4-乙烯基吡啶)(P4VP)和带正电的P4VP (PC-P4VP)薄膜表面的结合亲和力。h Pri57和PC91的圆柱形顶层纳米通道内YmPh-LCI结合示意图。所有误差柱表示三个独立实验(n = 3)的平均值的标准差。源数据作为源数据文件提供。

据报道，由于静电相互作用增强了底物捕获和产物释放方面的传质，相反电荷的表面/底物增强了固定化酶在固体表面上的催化性能50。在我们的研究中，考虑到带相反电荷的纳米通道壁和衬底之间的静电吸引力(即带正电的纳米通道表面和带负电的InsP6/InsP中间体)，我们预计相应的静电吸引力可能会延长衬底与纳米通道壁的接触时间，从而增强InsP6和InsP中间体的水解。此外，由于InsP6与纳米通道之间的静电吸引力更强，具有6个带负电荷的磷酸基团的InsP6与带正电荷的纳米通道壁的平均接触时间可能比磷酸基团较少的InsP中间体长。较长的接触时间和InsP6对磷酸的逐步水解可能导致纳米通道最上层的局部浓度梯度陡峭且逐步增大。因此，高的特定植酸酶活性保证了InsP6快速有效地逐步水解为InsP2。

在CInsP6 = 100 mM，通量为7.2 ~ 7.5 L m-2 h-1的条件下，PC91连续反应的长期运行稳定性。误差条表示三个独立实验的平均值的标准差(n = 3)。b高性能、不间断连续、单通流反应示意图。部分图表改编自参考文献20 (CC BY 4.0 DEED)。

一种通用的、可扩展的、强大的流动反应器设计概念，能够制造高性能、连续流动和生物功能化的NaMeR，并通过在30天内实现约2147 mol / m2膜的生产力和在30天内高达1.05 × 105 g L−1 d−1的时空产率成功验证。这种优异的催化性能是通过精心设计的可伸缩纳米和等孔BCP膜作为载体，弥补了纳米通道和酶的尺寸差距，并通过MBP (LCI)定向固定植酸酶来实现的。对不同纳米通道尺寸和纳米通道内正电荷装饰的研究表明，负电荷底物(即InsP6和InsP中间体)的生产率有很强的提高作用。因此，调整纳米通道特性可能是最大限度提高NaMeR生产率的关键性能和一般设计参数。总之，我们认为设计的概念是通用的和可扩展的，因为等孔BCP膜的设计灵活性，以及通过MBP可扩展/定向固定酶(补充图33，补充注释4.4-4.9)。InsP6的逐步转化表明，当各种催化剂可以以特定的方式固定在纳米通道内时，该设计概念可能用于多催化过程。基于高生产率/性能，简单的操作，灵活性和设计的可扩展性，我们设想开发的NaMeR概念将在散装和精细化学品的酶生产中具有广泛的合成价值。

Doi: https://doi.org/10.1038/s41467-024-47007-y‍

原标题：Nature Communication | 基于孔径匹配的纳米和等孔嵌段共聚物膜的酶促连续流反应器文章来源：Ivy Nano Medicine

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