警惕！WB 内参蛋白并不稳定可靠，选错内参竟惨遭延毕、撤稿、撤销职称

谈起 Western blot 技术，可谓是赫赫有名，无人不知，无人不晓。1979 年，Western blot 技术首次问世，从此开始了波澜壮阔的发展史，截止目前，仅仅在 PubMed 收录的与 Western blot 相关文献已经超过 40 万篇！

这些数据足以证明 Western blot 技术自诞生以来经受的科学验证价值，以及实验价值的不可替代性 ‌。它在科学殿堂里犹如璀璨的明珠，照亮了一代又一代科研人员的学术道路，为无数人的实验结果和论文产出立下汗马功劳。

然而，关于 Western blot 技术的痛点亦是层出不穷，无信号、条带模糊、背景噪音大、条带异常拖尾、非目标蛋白出现等实验翻车名场面频频发生。总之，它有时候就像一门玄学，令人头痛不已。

内参蛋白选错，后果有多严重？

这不，连 WB 中最后的倔强和体面---内参蛋白（Internal Control，Loading Control，如 β-actin、GAPDH 等）也开始作妖，实验人员一旦对内参蛋白理解不到位，导致选择不慎，轻则实验失败，数据失真，重则论文撤稿，极大地影响个人学术声誉和职业前途。

来源：NCBI

这篇论文发表于 2019 年，时隔 5 年被一位火眼金睛的读者「举报」，最终惨痛撤稿，据说当事人原本唾手可得的职称评定因此受阻。

其主要撤稿原因之一是内参 GAPDH 蛋白条带（各蛋白泳道对应不同的实验处理）竟然「一带多用」，被用来控制三个不同的血管内皮生长因子（VEGF）条带，即分别对应于烧伤后不同恢复时间获得的兔角膜。

如此离谱操作，WB 内参的有效性怎能得到保证呢？

来源：NCBI

WB 内参蛋白的稳定可靠性并不理想

上述被撤稿的论文最大的问题是忽略了 WB 内参蛋白的破坏力，高估了它们在不同实验条件下的稳定可靠性。

而很多科研人正在不知不觉地陷入内参蛋白的温柔乡里，忽视了背后的实验风险。

• 为什么 WB 条带总是不齐？

• 为什么同一组数据重复三次，内参灰度值波动值超出正常范围？

• 为什么目的蛋白明明有变化，却被内参 「 平均 」 掉了？

上述一切诡异事件都和选错内参蛋白紧密相关。以往的有限认知里，不少研究人员认为 β-actin、GAPDH 等蛋白在不同实验处理下表达量能够保持恒定，故将其作为标准化参照 ‌。

然而，大量文献证据表明，在多种实验条件（如细胞应激、药物处理、疾病模型）下，这些蛋白的表达水平会发生显著波动 ‌。

例如，缺氧、代谢紊乱等病理条件可诱导 β-actin 表达下调 ‌，细胞周期同步化处理会导致 GAPDH 表达波动，这都是前人们的血泪之谈！

换而言之，不根据实际情况灵活处理，一味地固守经验之谈，选错内参，WB 数据可能严重失真。

来源：NCBI

选错内参后，以下大坑将随之而来：

• 假阴性：内参蛋白表达量过高或过低时，目标蛋白的真实表达情况被影响；

• 假阳性：内参表达波动（如 GAPDH 在代谢干预实验中会变化），数据趋势被扭曲；

• 重复性差：不同批次实验中内参表达不一致，导致结果无法横向对比。

有网友亲自现身血泪史，沿袭着师兄师姐的实验操作，一直将 GAPDH 视为唯一的内参蛋白，结果发现它在自己的实验材料里竟然属于差异表达基因，P 值达到 0.03。

所有的 qPCR 和 WB 实验白做，辛辛苦苦三年，读研归来还是新人，在延毕的边缘不断试探，这是多么令人崩溃和痛心。

来源：网络

也有网友深陷课题组 「 一种内参蛋白得天下 」 的困局，其基因过表达实验结果长期一塌糊涂，在更换实验室唯一官方认定内参之后，被导师痛批，认为网友是在胡说八道。

由此可见，对于内参基因和蛋白的认知，还有很长的一段路要走！

来源：网络

还有网友明明用 BCA 测完调齐过蛋白浓度，可是内参蛋白 β-actin 的条带总是深浅不一（如下图条带所示）。

该网友甚至把上样量按照 β-actin 重新做了调整，但是目的蛋白的趋势神奇地消失了。一时之间让人分不清楚，到底谁是内参蛋白，谁是目的蛋白。

来源：网络

还有网友 WB 实验的同一张膜上目的蛋白都有条带，可是内参第一次显影的时候却消失不见，排除了二抗的问题，内参蛋白却依然不见踪影。

来源：网络

不得不说，WB 是门玄学，也有网友以亲身经历给予指导，充分展示了什么叫作因地制宜，灵活运用内参蛋白。

该网友检测病理模型的脂肪组织时，发现 actin 蛋白表达极低，且因为分子量大小与免疫球蛋白接近，容易出现双带，因此果断选择 GAPDH。而在细胞里，则灵活地继续选择 actin。

来源：网络

不得不说，这位网友算是拿捏住内参蛋白的命脉了！

审时度势，破解内参蛋白选择困局

选择内参蛋白如此重要，小伙伴们一定要慎之又慎。

首先，在选择内参蛋白时，遵循稳定性优先原则，优先选择高特异性抗体，结合预实验，通过灰度值计算内参的变异系数。一般而言，变异系数小于 15% 是值得信赖的内参蛋白。

其次，明确实验样本类型，根据物种、组织来源、亚细胞定位缩小候选范围，既不可全部遵循师兄师姐的经验，也不可标新立异，导致实验不断走弯路。

在此学霸君为大家准备一份常见的内参蛋白选择指南。

来源：学霸君自制

当然了，还可以借助生物信息分析手段为选择内参蛋白保驾护航。

• Human Protein Atlas（https://www.proteinatlas.org）
  

  查询内参蛋白在人类组织中的表达稳定性

• ICG 数据库：（https://ngdc.cncb.ac.cn/icg/）
  

  提供多物种内参基因稳定性数据

• qBase+软件：

  集成 geNorm、NormFinder 算法，一键分析内参稳定性。

同时，还要考虑目的蛋白分子量大小，匹配恰当的实验条件，考虑转膜时间长短和封闭试剂的种类。

例如，为了避免内参蛋白条带与目的蛋白条带在电泳分离过程中发生重叠，影响结果判断，要确保内参蛋白分子量与目的蛋白有明显差异。

倘若目的蛋白分子量为 50 kDa 左右，那么选择分子量 42 kDa 的 β-actin 作为内参是相对合适的。

总之，对待 WB 实验得长一万个心眼，每一个环节都不容忽视，别再让错误的内参蛋白毁了实验心血。把握细节，仔细处理，数据真实，方能 paper 稳稳到手。

各位小伙伴还有什么关于 WB 实验的血泪史吗，一起在评论区分享交流吧！

题图来源：图虫创意

我们长期为科研用户提供前沿资讯、实验方法、选品推荐等服务，并且组建了 70 多个不同领域的专业交流群，覆盖PCR、细胞实验、蛋白研究、神经科学、肿瘤免疫、基因编辑、外泌体、类器官等领域，定期分享实验干货、文献解读等活动。

添加实验菌企微，回复【】中的序号，即可领取对应的资料包哦～

【2401】论文写作干货资料（100 页）

【2402】国内重点实验室分子生物学实验方法汇总（60 页）

【2403】2024 最新最全影响因子（20000+ 期刊目录）

【2404】免疫学信号通路手册

【2405】PCR 实验 protocol 汇总

【2406】免疫荧光实验 protocol 合集

【2407】细胞培养手册

【2408】蛋白纯化实验手册

【2501】染色体分析方法汇总

【2502】国自然中标标书模板

【2503】WB 实验详解及常见问题解答

【2504】DeepSeek 论文写作常用口令

【2505】中国科学院期刊分区表（2025 年最新版）