北京
2025年3月14日，广州医科大学附属市八医院李锋团队在Antiviral Research发表了题为“
A hepatitis B virus-free cccDNA-producing stable cell for antiviral screening” 的研究论文。研究构建了一种无需病毒感染即可持续产生 HBV cccDNA 的稳定细胞系，该模型中， HBV cccDNA 表达一种可分泌的荧光素酶（ Gaussia Luciferase ， GLuc ），可非常简便地用于 HBV cccDNA 形成、维持、活性调节等的机制研究与药物高通量筛选。
实现HBV功能性治愈是目前临床治疗的理想目标。尽管现有抗病毒药物可有效抑制HBV病毒复制，有些患者也可实现功能性治愈，但，现在治疗策略对HBV cccDNA（共价闭合环状DNA）无能为力，HBV cccDNA在体内不但持续存在，而且可以活跃转录产生pgRNA，生产子代病毒。开发直接靶向HBV cccDNA的新型抗病毒药物迫在眉睫，然而，可供研究HBV cccDNA的细胞模型较少。一方面，HBV cccDNA 特异性检测技术不足。HBV cccDNA在细胞内的水平低，且与其他HBV病毒复制中间产物序列高度相似，常规PCR检测方法难以区分，经典Southern Blot方法灵敏度不够。另一方面，缺少适用于直接靶向HBV cccDNA的高通量药物筛选模型。
为克服以上难题，李锋团队开发设计了一种能够自主产生HBV cccDNA的细胞系。该系统具有以下特点。1.胞内HBV cccDNA水平提高。1）为避免插入报告基因增加HBV基因组长度导致病毒包装效率降低，该体系中利用功能互补策略，将病毒蛋白的产生和HBV前基因组RNA（pgRNA）生成分为两个独立部分，HBV病毒蛋白Core、Pol和HBx位于辅助部分（Helper），pgRNA provider的长度得到有效缩短，不会受插入报告基因的影响。2）该体系不表达HBsAg病毒蛋白，所转录产生的pgRNA均导向细胞内HBV cccDNA内循环。2.荧光素酶报告基因可作为活跃转录HBV cccDNA的替代性标志物。1）Gaussia荧光素酶仅来源于所形成的HBV cccDNA reporter，通过Gaussia荧光素酶（Gluc）报告系统精确反映细胞内cccDNA水平。2）Gluc以分泌形式释放到细胞培养基中，可轻松实现对同一实验孔中HBV cccDNA的连续检测。3. 双荧光素酶系统。同时，稳定表达HBV cccDNA的细胞基因组中引入萤火虫荧光素酶报告系统，可用于评估药物毒性与细胞活性。
图. 细胞系中携带Gluc报告基因的HBV cccDNA形成示意图
在高通量筛选的概念验证测试中，团队利用该细胞系对2074种化合物进行高通量药物筛选，最终鉴定出4种具有HBV cccDNA显著抑制活性的候选药物，初步证实了该筛选平台的有效性和实用性。该研究为探索HBV cccDNA生成与稳定机制提供了有力工具，也为抗HBV新药研发创造了便利条件。
本研究得到了广州市重点研发计划等多个项目资助。广州医科大学附属市八医院传染病研究所李锋研究员为本文的通讯作者，冯成千、石静蓉、陈允甫与陈思思为本文的共同第一作者。
原文链接：https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2025.106143
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